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Interacción molecular de los receptores CRH-R2 y DA-D1 en el área tegmental ventral de rata.
(2013) Araya Gutiérrez, Katherine Angélica; Gysling Caselli, Katia; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La administración repetida de drogas de abuso genera cambios plásticos perdurables que se traducen en alteraciones en las propiedades funcionales de las neuronas del sistema mesocorticolímbico, como lo es la sensibilización de la liberación de glutamato en el área tegmental ventral (VTA) inducida por la administración repetida de cocaína, esto determina la recaída a la droga (Wang y cols. 2005). Dicha sensibilización estaría siendo modulada por la activación de receptores dopaminérgicos D1 (DA-D1) y de los receptores CRH-R2. Por otra parte, se ha observado que la administración repetida de cocaína también induce una facilitación de la transmisión glutamatérgica presináptica, en la corteza prefrontal (CPF), dicha facilitación glutamatérgica estaría mediada por la co-activación de receptores CRH-R2 y DA-D1, sugiriendo que dichos cambios estarían ocurriendo por uno o más mecanismos como: cooperatividad entre los receptores, vías de señalización en común y/o por la formación de heterómeros de los receptores DA-D1 y CRH-R2. La interacción funcional y/o molecular de receptores metabotrópicos o heterómeros de receptores, ha aportado interesantes hallazgos sobre la regulación de la liberación de glutamato en núcleos del cerebro como el Cuerpo Estriado. En base a estos antecedentes no propusimos estudiar el papel de los receptores DAD1 y CRH-R2 en la sensibilización de la liberación de glutamato en el VTA inducida por la administración repetida de cocaína. Nuestros resultados muestran que existe una interacción funcional entre dichos receptores sólo en las ratas expuestas al tratamiento repetido con cocaína. Con respecto a la localización, hemos determinado que existe un 34,1 % de la población de terminales glutamatérgicos de origen subcortical que poseen receptores DA-D1 y CRH-R2. Finalmente, hemos demostrado por varias técnicas que existe una interacción molecular entre los receptores CRH-R2 y DA-D1.
Systemic characterization of the oxygen response of the wine yeast saccharomyces cerevisiae EC1118 in oenological conditions.
(2013) Aceituno Aceituno, Felipe Eduardo; Agosin T., Eduardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Discrete oxygen additions play a critical role in alcoholic fermentation. However, few studies have quantified the fate of the dissolved oxygen and its impact on wine yeast cell physiology, under oenological conditions. We simulated the range of dissolved oxygen concentrations that occur after a pump-over during the wine making process, by sparging nitrogen-limited continuous cultures with oxygen-nitrogen gaseous mixtures. Metabolic Flux Analysis was performed with a custom-built model. This indicated that when the dissolved oxygen concentration increases from 1.2 to 2.7μM, yeast cells change from a fully fermentative to a mixed respiro-fermentative metabolism. This transition was characterized by a switch in the operation of the tricarboxylic acid cycle (TCA), and an activation of NADH shuttling from the cytosol to mitochondria. Nevertheless, fermentative ethanol production remained the major cytosolic NADH sink for all oxygen conditions, suggesting the limitation of mitochondrial NADH reoxidation as the major cause of the Crabtree effect. This is reinforced by the induction of several key respiratory genes by oxygen, despite high sugar concentrations, indicating that oxygen overrides glucose repression, which was thought to be the cause of the Crabtree effect. Genes associated with other processes such as proline uptake, mannoproteins and oxidative stress are also significantly affected by oxygen. Our data suggests that oxygen can be beneficial at low levels, improving proline uptake and reducing acetic acid. On the contrary, high oxygen levels can reduce mannoproteins, important for haze removal and wine mouthfeel, and even stress yeast to the point of reducing its metabolic capacity when in excess, highlighting the dual role of oxygen in “making or breaking wines”. Even though oxygen was promptly consumed under oenological fermentation conditions, we wondered which pathways accounted for biological oxygen consumption. By means of a genome-scale, unbiased metabolic model, we determined that most oxygen is consumed by respiration. This is concordant with our experimental analyses that showed a minor contribution of non-respiratory pathways (such as ergosterol and lipid biosynthesis) to the overall oxygen consumption, and a major contribution of the respiratory-coupled proline assimilation pathway. Altogether, these results strongly indicate that oxygen consumption, when limiting, is more critical for nitrogen assimilation and respiration than for lipid synthesis. To the best of our knowledge, this work is the first to globally assess the effects of oxygen on yeast physiology under a high-sugar, nitrogen-limited culture setting simulating oenological conditions. From this data, we determined optimal and deleterious oxygen conditions that can be chosen or avoided in wine making. Regarding yeast physiology, while several data can be extrapolated from carbon-limited physiology (such as TCA splitting in anaerobiosis), it is striking that respiration is responsible for a substantial part of the oxygen response in yeast cells during alcoholic fermentation, contrary to the widespread belief that respiration is under glucose repression in these conditions. Nevertheless, respiration does not surpass fermentation as the main energy-providing pathway, in a way analogous to what is seen in cancer cells that show the “Warburg effect”, this is, aerobic ethanol production. Therefore, the study of the oxygen response in nitrogen-limited yeast cells can provide relevant information on how to manage oxygen to impact positively wine quality, but is also as a model for other relevant biological systems.
Taxonomía, filogenia y filogeografía de la familia Scytosiphonaceae (Phaeophyceae), con énfasis en el origen y distribución del género Scytosiphon en la costa Pacífico sureste.
(2013) Camus Torres, Carolina; Correa M., Juan A.; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Synthesis and degradation of indole-3-acetic acid by Burkholderia phytofirmans PsJN
(2013) Donoso Luna, Raúl Andrés; González Ojeda, Bernardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Se ha descrito que las rizobacterias promotoras del crecimiento de plantas (PGPR) usan múltiples mecanismos para producir su efecto benéfico sobre las plantas, tal como la síntesis de la fitohormona auxina ácido indol-3-acético (IAA). Se han propuesto varias vías de biosíntesis del IAA en bacterias, con triptófano como su principal precursor. Por otro lado, se han reportado bacterias capaces de utilizar IAA como única fuente de carbono y energía, asociando esta habilidad con los genes iac, aunque la función y regulación de estos genes es escasamente comprendida. Además, es sabido que las plantas usan múltiples mecanismos para alcanzar la homeostasis de auxinas, incluyendo su biosíntesis y catabolismo. En este contexto, se ha propuesto que las bacterias que poseen simultáneamente genes relacionados a síntesis y degradación de IAA podrían controlar las asociaciones planta-bacteria.Este sería el caso de la β-proteobacteria Burkholderia phytofirmans PsJN, capaz de establecer interacciones benéficas con plantas, debido a que posee habilidades de biosíntesis y degradación de IAA. Se determinó que la cepa PsJN produciría IAA mediante al menos tres vías funcionales diferentes de biosíntesis dependientes de triptófano. Además, se observó que la cepa PsJN usa IAA como única fuente de carbono y energía empleando los genes iac para este propósito, y se propusieron los pasos en que cada gen estaría involucrado en la degradación de IAA. Asimismo, se reportó que iacA, iacF e iacG presentan redundancia funcional y revelamos algunas pistas sobre la regulación de los genes iac. Adicionalmente, se determinó que la degradación de IAA juega un papel en la promoción de crecimiento de plantas. Por otra parte, se observó que la degradación de IAA a través de los genes iac fue reprimida por la presencia de triptófano, pero, sorprendentemente, cuando el metabolismo de triptófano está activado el IAA es degradado a través de una vía independiente de los genes iac. En conclusión, estos resultados sugieren que existe una compleja regulación en el metabolismo de IAA en B. phytofirmans PsJN.
Los plasticidas Bisfenol-A y Nonilfenol inducen apoptosis de células germinales durante la espermatogénesis a través de un mecanismo dependiente de la ADAM17.
(2013) Lagos Cabré, Raúl Cristián; Moreno Mauro, Ricardo D.; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Los xenoestrógenos son moléculas con actividad estrogénica y antiandrogénica, que pueden interferir en procesos biológicos como la espermatogénesis, aumentando la apoptosis de las células germinales. El bisfenol-A y el 4-nonilfenol son dos xenoestrógenos que se encuentran abundantemente en el medio ambiente y que producen muerte de las células germinales en los testículos de rata. Además, estos compuestos afectan negativamente a los niveles hormonales y las características sexuales secundarias de los animales y humanos, las que pueden ser heredadas a la progenie, demostrando, también, que poseen efectos transgeneracionales. La espermatogénesis es el proceso por el cual se generan los espermatozoides, gametos masculinos, a partir de una célula diploide llamada espermatogonia y culmina con la liberación de un espermatozoide especializado, haploide pero sin motilidad, la que se adquiere en el epidídimo. Este proceso es especialmente sensible a los xenoestrógenos y los efectos negativos de estos compuestos sobre la espermatogénesis han sido ampliamente documentados. Sin embargo, sólo unos pocos artículos detallan algunos mecanismos que pueden ser activados por dichos xenoestrógenos. El objetivo de esta tesis es determinar qué mecanismos están involucrados en la muerte de las células germinales inducida por xenoestrógenos. En este sentido, a partir de datos preliminares de nuestro laboratorio e información publicada por otros grupos, proponemos que las proteínas de la familia ADAM participan en los efectos negativos provocados por los xenoestrógenos. Las proteínas ADAMs son metaloproteasas de la membrana celular, que tienen la función de liberar los ectodominios de sustratos al medio externo desde la membrana plasmática y modificar la matriz extracelular. La actividad de algunos miembros de la familia ADAM se relaciona con la muerte por apoptosis, que ocurre durante la espermatogénesis, y es sabido que estas metaloproteasas son activadas por distintos estímulos externos, como drogas, estrés oxidativo, proteínas quinasas y aumento de la concentración de ion calcio intracelular ([Ca2+]i). El miembro más estudiado y ubicuo de esta familia es la ADAM17, la cual está relacionada con la apoptosis de células germinales activada con etopósido, una droga anti cancerígena. Hemos probado que en el modelo utilizado (Rata) responde a los xenoestrógenos, ya que aumentó la muerte de células germinales en testículos de rata de 21 días de edad, que corresponde a ratas prepuberales, siendo un modelo excelente para el estudio del efecto de los xenoestrógenos debido a que estos compuestos actúan en ciertas etapas del desarrollo afectando de mayor manera el tracto reproductivo. Además, observamos que aumentan las especies reactivas de oxígeno (ROSs) en testículos de rata tratadas con xenoestrógenos, lo que concuerda con datos expuestos en la literatura. La inhibición farmacológica de la ADAM17 previno significativamente la muerte inducida por estos xenoestrógenos, sugiriendo que esta metaloproteasa participa en este mecanismo. Las ROSs generadas por los xenoestrógenos pueden ser en parte responsables de la muerte celular inducida por xenoestrógenos, ya que en células tratadas con antioxidantes la apoptosis disminuye, al igual que lo observado con la inhibición de p38MAPK, la cual reduce significativamente la muerte celular inducida por xenoestrógenos. Los niveles proteicos de la ADAM17 no cambiaron en presencia de xenoestrógenos, sugiriendo que los xenoestrógenos podrían actuar aumentando la actividad de la ADAM17. Para comprobar esto, estudiamos la localización de la ADAM17 en la superficie celular, ya que es una buena aproximación a la activación de esta metaloproteasa, debido a que sólo la ADAM17 activa se localiza en membrana. Observamos que efectivamente aumenta la localización de la ADAM17 en la superficie de las células germinales aisladas, lo que fue dependiente de la activación de p38MAPK. Esta interpretación fue apoyada por resultados obtenidos en células transfectadas con un sustrato de la ADAM17 acoplado a fosfatasa alcalina, lo que permite estudiar de forma indirecta la actividad de la ADAM17, mediante la medición de la actividad fosfatasa en el medio de cultivo. Los resultados fueron consistentes con los de la ADAM17 en la superficie celular. Para identificar el mecanismo que activa la ADAM17, propusimos estudiar si los aumentos de la [Ca2+]i producido por los xenoestrógenos participan en la activación de la ADAM17. Observamos que la ADAM17 responde al aumento de la [Ca2+]i inducido con un ionóforo de Ca2+, y que la actividad de la ADAM17 disminuye en presencia de quelantes de Ca2+ o del uso de una solución extracelular libre de Ca2+. Los xenoestrógenos aumentan la [Ca2+]i por un mecanismo que puede involucrar ingreso de Ca2+ desde el exterior o liberación de Ca2+ de reservorios intracelulares. Nuestros resultados muestran que la ADAM17 responde al ingreso y no a la liberación de Ca2+ de reservorios internos. Por esto, decidimos estudiar si este ingreso de Ca2+ podría estar mediado por hemicanales formados por pannexinas, los que son permeables a Ca2+, por lo tanto podrían mediar aumentos en la [Ca2+]i debido a que están acopladas a receptores P2X. La activación de la ADAM17 inducida por xenoestrógenos no se relacionó con un aumento en la permeabilidad de los hemicanales formados por pannexinas, debido a que los inhibidores de estos no redujeron la actividad de la ADAM17 ni su localización en membrana. Aún así, nuestros resultados avalan la participación de la ADAM17 como un nuevo miembro del mecanismo de la muerte celular inducida por xenoestrógenos, un proceso dependiente de la p38MAPK y estrés oxidativo.
La nitración de proteínas contribuye a la potenciación quimiosensorial del cuerpo carotídeo de ratas sometidas a hipoxia intermitente.
(2013) Moya Céspedes, Esteban Alexis; Iturriaga Agüera, Rodrigo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La hipoxia se manifiesta en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas en los seres vivos. Entre ellas, uno de los patrones de hipoxia más común es la hipoxia intermitente crónica que consiste en la ocurrencia de eventos de hipoxia de corta duración seguidos por episodios de normoxia, tal como ocurre en el síndrome de apnea obstructiva del sueño. Numerosos reportes demuestran que la hipoxia intermitente contribuye al desarrollo de alteraciones cardiovasculares e hipertensión que sufren los pacientes con apnea obstructiva del sueño. De hecho, se ha demostrado que, pacientes con apnea obstructiva del sueño o animales sometidos a hipoxia intermitente crónica, presentan potenciación de los reflejos ventilatorios, simpáticos y cardiovasculares en respuesta a la hipoxia aguda. Este aumento de respuestas ha sido atribuido a la potenciación de la reactividad de los quimiorreceptores del cuerpo carotídeo.La potenciación quimiosensorial carotídea consiste en un aumento de la frecuencia de descarga de potenciales de acción del nervio carotideo en respuesta a un estímulo hipóxico agudo, pero los mecanismos celulares asociados a este fenómeno no se conocen completamente. Pese a esto, se sabe que la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y en particular el radical superóxido (O2 -) contribuyen a la potenciación quimiosensorial, ya que la administración de antioxidantes y/o agentes miméticos de las superóxido dismutasas (SODs) previenen la potenciación quimiosensorial. Resultados obtenidos en nuestro laboratorio muestran que marcadores relacionados con el estrés oxidativo o las respuestas inflamatorias podrían estar implicados en la generación de la potenciación quimiosensorial, sin embargo, de ellas, sólo la formación de residuos de 3-nitrotirosinas (3-NT) presenta un correlato temporal con la aparición de la potenciación quimiosensorial. El O2 - y el óxido nítrico pueden reaccionan formando radical peroxinitrito, que modifica residuos de tirosina generando 3-NT. Por lo tanto, decidimos estudiar un posible mecanismo que explicara cómo, la formación de 3-NT, puede contribuir a la potenciación quimiosensorial del cuerpo carotídeo.Una de las proteínas susceptibles a sufrir nitración es la manganeso SOD (MnSOD). Esta enzima mitocondrial, normalmente regula los niveles tóxicos de O2 -, pero presenta disminución de su actividad catalítica cuando es modificada por nitración en su sitio activo. Dado que los niveles de O2 - dependen de la actividad catalítica de la MnSOD, cabe esperar que una disminución en su actividad por nitración aumente los niveles de ROS en las células quimiorreceptoras de cuerpo carotídeo, contribuyendo a la potenciación quimiosensorial. Estudiamos el efecto de la hipoxia intermitente sobre la actividad quimiosensorial, los niveles de MnSOD y 3-NT en el cuerpo carotídeo de rata. Analizamos si la hipoxia intermitente genera cambios en la actividad de la MnSOD y si estos cambios se relacionan con la nitración de esta enzima.Los resultados descritos en esta Tesis doctoral demuestran que la exposición a hipoxia intermitente crónica por 5 días produce aumento de la actividad del nervio carotídeo en respuesta a un estímulo de hipoxia aguda y que este aumento se mantiene luego de 7 días de hipoxia intermitente. Que cuerpos carotídeos de ratas sometidas a 3 días de hipoxia intermitente presentan aumento en los niveles de 3-NT, los que se mantienen altos luego de 5 y 7 días de exposición a hipoxia intermitente. Dado que el CB tiene un pequeño tamaño (500 μm de diámetro), usamos a las células cromafines de la médula adrenal como modelo de las células glómicas del CB. Encontramos que la exposición a 7 días de hipoxia intermitente también aumenta los niveles de 3-NT en las médulas adrenales. Además, encontramos que en ratas sometidas a hipoxia intermitente la actividad de la MnSOD se encuentra disminuida en las médulas adrenales pero aumentada homogenizados de cuerpo carotídeo, y que dichos cambios son prevenidos al administrar ácido ascórbico como antioxidante.Por otra parte encontramos que, en ratas expuestas a hipoxia intermitente, no cambian los niveles de MnSOD en las médulas adrenales, pero sí están aumentados en homogenizados de cuerpo carotídeo. Sugiriendo que el aumento de actividad de la MnSOD en los cuerpos carotídeos se debe a un aumento de sus niveles. Al medir los niveles de MnSOD nitrada a través de ensayos de co-inmunoprecipitación, encontramos que tanto en las médulas adrenales, como en los cuerpos carotídeos, los niveles de MnSOD nitrada en ratas sometidas a hipoxia intermitente es mayor que en las ratas controles, y que este aumento es prevenido con el tratamiento con antioxidantes. Pese a que el aumento de actividad observado en los cuerpos carotídeos de ratas sometidas a CIH, descarta la contribución de la nitración de la MnSOD en la potenciación quimiosensorial, decidimos estudiar la contribución del radical peroxinitrito (inductor de la nitración) y de los ROS mitocondriales sobre la actividad quimiosensorial usando distintos antioxidantes. MitoTEMPO (específico contra ROS mitocondriales) y Ebselen (específico contra peroxinitrito), previenen el desarrollo de la potenciación quimiosensorial del CB. Además la administración de Ebselen revierte el aumento de la presión arterial inducido por hipoxia intermitente. Estos resultados permiten concluir que la nitración de la MnSOD no está involucrada en el aumento de actividad quimiosensorial evocada por CIH. La producción de peroxinitrito y/o de ROS mitocondriales son fundamentales para desarrollar la potenciación quimiosensorial del cuerpo carotídeo observada en ratas sometidas a hipoxia intermitente. Y el tratamiento con Ebselen revierte la hipertensión inducida por CIH.
Restoration of nNOS\03BC function in the MDX mouse model of Duchenne muscular distrophy.
(2013) Rebolledo López, Daniela Victoria; Froehner, Stanley C.; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La Óxido Nítrico Sintasa Neuronal (nNOS) es una enzima regulada por Ca2+/calmodulina que sintetiza óxido nítrico (ON) desde L-arginina. Existen al menos 4 variantes de splicing para nNOS. nNOS\03BC es una isoforma que posee un inserto de 34 aminoácidos y que es específicamente expresada en músculo esquelético y cardiaco. En el músculo normal, nNOS\03BC se localiza principalmente en el lado citosólico de la membrana plasmática, el sarcolema, por unión a \03B1-sintrofina, un miembro del complejo glicoproteico asociado a la distrofina (DGC). La localización sarcolemal de nNOS\03BC es crítica para oponerse a la vasoconstricción simpática y mantener un flujo sanguíneo apropiado a los músculos activos durante el ejercicio. La expresión, localización sarcolemal y/o la señalización de nNOS\03BC se encuentran alteradas en varias enfermedades neuromusculares, incluyendo la distrofia muscular de Duchenne (DMD). DMD es un desorden devastador ligado al cromosoma X que comienza en la niñez con dificultad para caminar y correr; progresa con la pérdida de la capacidad ambulatoria en la adolescencia temprana, seguido por perdida de la función de brazos, tronco, y fallas cardiacas y respiratorias. La muerte es común en la adultez temprana. DMD, y el desorden alélico menos severo, la distrofia muscular de Becker, se producen por mutaciones en el gen de la distrofina. En éstas y otras distrofias musculares, existe una necesidad crítica y urgente por tratamientos seguros y eficaces para disminuir la progresión de la enfermedad. Tales terapias reducirán la carga de la enfermedad, mejorarán la calidad de vida y otorgarán tiempo hasta que los tratamientos que se dirigen al defecto genético primario estén totalmente desarrollados, sean económicamente alcanzables y ampliamente distribuidos.
Complejidad de los efectos no letales de depredadores y su transmisión en tramas tróficas : experimentos en terreno y laboratorio con organismos intermareales.
(2013) Manzur Castillo, Tatiana; Navarrete C., Sergio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Las interacciones depredador-presa han sido ampliamente reconocidas como un factor crítico en la dinámica de sistemas ecológicos, reconocimiento que se ha basado primordialmente en el aspecto letal de la depredación (i.e. cuantas presas son consumidas por el depredador). Sin embargo, en todos los sistemas naturales los depredadores también pueden afectar la demografía, distribución y evolución de las especies presa a través de los costos de las respuestas antidepredatorias desplegadas para reducir su susceptibilidad a la depredación, respuestas que se entienden como \201Cefectos no letales\201D de los depredadores (ENL). Además de influir fuertemente sobre la dinámica de las poblaciones presa, los ENL de los depredadores pueden también propagarse a través de la trama trófica como efectos indirectos mediados por rasgo (EIMR), afectando la estructura, diversidad y las dinámicas de comunidades completas. El escape activo es una de las respuestas antidepredatorias ampliamente reportadas en diversos taxa marinos. Para que un escape sea exitoso, las presas deben ser capaces de detectar y evaluar el riesgo de depredación idealmente antes de un contacto físico, utilizando señales o información provenientes del depredador o del medio ambiente. La distancia a la que una presa reacciona a la presencia de su depredador (distancia de detección), la extensión espacial y la duración de la respuesta de escape, junto con las tasas de encuentro entre depredador y presa son determinantes de la escala espacio-temporal del ENL del depredador en un sistema y de la importancia ecológica que dicho efecto tendrá a escalas o niveles de organización mayores (e.g. poblacional). No obstante, la aproximación metodológica que han empleado la mayoría de los trabajos que estudian ENL y su transmisión a otros niveles tróficos raramente ha considerado en forma explícita o implícita la escala \2018natural\2019 de las interacciones, lo que podría redundar en la problemática de extrapolar los resultados de manipulaciones experimentales a lo que ocurre efectivamente en la naturaleza. Por otro lado, la expresión de respuestas antidepredatorias supone un costo para las presas que puede manifestarse como una reducción en sobrevivencia, crecimiento o reproducción y, por lo tanto, es esperable que estas respuestas sean rápidas, flexibles (reversibles), especificas y conmensurables con el nivel de riesgo real, minimizando dichos costos. Sin embargo, pocos son los estudios que han cuantificado directamente los costos de estas respuestas y cómo estos pueden influenciar la magnitud y dirección de los efectos indirectos de los carnívoros sobre el nivel trófico basal transmitidos mediante cambios conductuales de los herbívoros. En esta tesis estudiamos los ENL de un depredador y su transmisión en tramas tróficas utilizando como sistema de estudio una trama trófica de tres niveles en el intermareal rocoso. Mediante combinación de manipulaciones experimentales en terreno y laboratorio se investigaron los ENL del depredador asteroideo Heliaster helianthus sobre rasgos de dos consumidores intermedios, el equinoideo Tetrapygus niger y el gastrópodo Fissurella limbata, así como la potencial transmisión de dichos efectos a algas (Ulva sp.) en el nivel trófico basal. El estudio evaluó la escala espacial y temporal en que ocurren estas interacciones, el efecto de estas escalas sobre la interpretación de manipulaciones experimentales, y los costos energéticos que conllevan estas respuestas para las presas. Se demostró que T. niger detecta a Heliaster a través de señales químicas difundidas en el agua hasta distancias de 50 cm y que la distancia recorrida en un escape es de alrededor de 40 cm. Es esperable entonces que el efecto del riesgo de depredación sea variable espacialmente. Manipulaciones experimentales de laboratorio demostraron que las respuestas dependen fuertemente del tiempo de exposición al riesgo y del tamaño del acuario en que se realizan las manipulaciones. Aunque se observaron algunos cambios de corto plazo en el forrajeo de los erizos en presencia de Heliaster, no se evidenció transmisión del ENL sobre Ulva sp. Finalmente, se demostró que en presencia del depredador, F. limbata aumentó rápidamente el consumo de oxígeno, las tasas de movimiento y las distancias recorridas, pero al contrario de muchos estudios anteriores en otros sistemas, F. limbata tendió a aumentar su actividad de forrajeo. En conjunto, los resultados sugieren que la respuesta antidepredatoria de esta presa es energéticamente costosa y que podría compensarse con un mayor consumo de algas. En general, mi estudio ilustra la importancia de cuantificar las escalas espacio-temporales de los ENL y la complejidad de cuantificar su transmisión a otros niveles tróficos en manipulaciones experimentales.
Mechanisms of lipodystrophy in the AGPAT2 deficient mouse
(2013) Cautivo Reyes, Kelly Margarita; Cortés Mora, Víctor Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
1-acilglicerol-3-fosfato O-aciltransferasa-2 (AGPAT2) es una enzima que normalmente se expresa en altos niveles en el tejido adiposo y cataliza la conversión de ácido lisofosfatídico (LPA) a ácido fosfatídico (PA), un paso fundamental en la biosíntesis de triglicéridos y glicerofosfolípidos. Mutaciones que inactivan el gen AGPAT2 causan reducción severa del tejido adiposo, tanto en seres humanos como en ratones, generando una condición patológica conocida como lipodistrofia generalizada. Los mecanismos por los cuales la deficiencia de AGPAT2 causa lipodistrofia son desconocidos. La hipótesis de este trabajo es que la falta de AGPAT2 altera el proceso de diferenciación que convierte a las células precursoras adiposas (preadipocitos) en adipocitos maduros, impidiendo, por lo tanto, la formación y expansión de tejido adiposo en los ratones Agpat2-/-. Para probar esta hipótesis se utilizó un enfoque experimental combinado, in vitro e in vivo. Estudios de adipogénesis in vitro con fibroblastos de embriones de ratón (FERs) reveló que la diferenciación adipogénica es anormal en múltiples niveles en los FERs Agpat2-/-.En primer lugar, la inducción adipogénica resultó en una alta proporción de FERs Agpat2-/- que mueren durante el proceso de expansión clonal mitótica (34 % frente a 6 % en los controles). Esto se tradujo en una proporción significativamente menor de células que progresaron a fases adipogénicas avanzadas y se correlacionó con una reducida activación de la vía de señalización de insulina. En segundo lugar, los FERs Agpat2-/- que lograron diferenciarse presentaron menor tamaño celular, menor contenido de lípidos neutros y gotas lipídicas pequeñas y desorganizadas, las cuales contienen una menor cantidad de Perilipina asociada a su superficie. Además, se observó presencia de múltiples agregados intracelulares de Perilipina no asociada a gotas lipídicas. El análisis de fetos en la última etapa de desarrollo intra uterino y de ratones recién nacidos reveló, inesperadamente, que tanto la masa total de tejido adiposo como su estructura tisular fue normal en estas etapas del desarrollo en ratones Agpat2-/-. Sin embargo, al segundo día después del nacimiento el tejido adiposo de los ratones Agpat2-/- fue rapidamente reemplazado por una elevada proporción de adipocitos en proceso de muerte celular, seguido por una masiva respuesta inflamatoria mediada por macrófagos. Finalmente, al sexto día después del nacimiento, el tejido adiposo fue indetectable en estos ratones, estableciendo un generalizado sindrome lipodistrofico. En resumen, los hallazgos de esta tesis demuestran que AGPAT2 es absolutamente necesaria para la supervivencia, el crecimiento y la diferenciación de los FER, así como para el crecimiento y viabilidad del tejido adiposo en la vida postnatal del ratón.
Physiological basis for nitrogen fixation in Cylindrospermopsis raciborskii strain CS-505 : an invasive, toxin-producing cyanobacterium that has radiated from tropical to temperate regions worlwide.
(2013) Muñoz Plominsky, Álvaro Alfredo; Vásquez Pérez, Luz Mónica; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Cyanobacteria are known for their ability to fix carbon and get energy through photosynthesis. Furthermore, some cyanobacteria are capable of fixing N2 when its environment lacks sources of combined nitrogen (diazotrophy). Because the enzyme that converts N2 to NH4 (nitrogenase) is irreversibly inactivated by atmospheric concentrations of O2, diazotrophic cyanobacteria must separate this process from photosynthesis, temporarily (e.g. by fixing N2 in the dark phase of the photoperiod) or generating a micro-oxic environment for nitrogenase. Thus, some multicellular cyanobacteria, which grow forming filamentous structures called trichomes, can differentiate specialized cells to fix N2 (heterocysts) when grown diazotrophically. Most studies have focused on cyanobacteria that differentiate intercalary heterocysts among the vegetative cells of their trichomes. Contrary, this thesis characterized the diazotrophic acclimatization strategy of a cyanobacterium that differentiates heterocysts only at the ends of its trichomes (terminal heterocysts): Cylindrospermopsis raciborskii strain CS-505.
Dispersión larval y patrones de conectividad en peces litorales de Chile Central.
(2013) Mansur, Lidia Elena; Ojeda Rossi, Federico Patricio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
En estudios de ecología marina, uno de los temas centrales es la conectividad o intercambio de individuos entre poblaciones marinas. Para muchas especies bentónicas con ciclos de vida complejo, este intercambio ocurre en los estadios larvales pelágicos. El pequeño tamaño de las larvas y su comportamiento, la dificultad en realizar seguimientos desde la eclosión de huevos hasta el asentamiento y las condiciones oceanográficas en las cuales se desarrollan estas especies, dificultan el entendimiento del fenómeno. No obstante esto, en las últimas décadas, a partir de aproximaciones directas e indirectas utilizando técnicas geoquímicas y genéticas, es posible determinar el rango geográfico de las poblaciones de especies bentónicas. Considerando los peces costeros, numerosos estudios sugieren que el rango de las poblaciones varía desde pocos a cientos e incluso miles de kilómetros. En este contexto, identificar la escala espacial en la que las poblaciones están demográficamente desconectadas es crucial para determinar, por ejemplo, áreas protegidas o estrategias de manejo. En el ambiente intermareal rocoso de la costa central de Chile, el ensamble de peces está caracterizado por dos componentes, especies “residentes” (luego de reclutar permanecen en el intermareal) y “temporales” (luego de alcanzar cierto tamaño migran al ambiente submareal). Considerando que representa un ambiente perturbado y que se encuentran especies de interes para la pesca artesanal, se plantea la necesidad de abordar estudios de conectividad. Para lo cual, se hace necesario conocer previamente la biología y ecología en la fase larval y recluta; como así también, realizar estudios que involucren una larga extensión espacial. El objetivo central de la tesis es analizar la capacidad de dispersión de peces litorales con diferentes estrategias de vida (residentes y temporales), de Chile central y determinar cuales son los mecanismos biofísicos que subyacen al fenómeno. Se seleccionaron las especies mas representativas de ambas estrategias de vida, Helcogrammoides chilensis (especie residente) y Girella laevifrons (especie temporal). En primer lugar se estimó la dispersión larval a partir de la determinación del período de permanencia larva en el plancton (PLD), la que permitió establecer como distancia máxima a la que podrían dispersar en 200 km. A su vez se determinaró la sincronía de los eventos de reclutamiento con las fases lunares. Considerando la distancia de dispersión, se realizó el análisis de la estructura genética en seis localidades ubicadas en el rango de dispersión a partir del análisis de ADN nuclear (AFLP). Se pudo determinar que los peces residentes presentan estructuración a distancias de hasta 10 km y que la dispersión está limitada por barreras oceanográficas principalmente la presencia de cuerpos de agua dulce. Por el contrario, las especies temporales con huevos y larvas pelágicos no presentan estructuración en el rango geográfico del estudio. Dicho fenómeno se explica en que las larvas al ser liberadas al plancton lejos de la costa, no se ven afectadas por eventos o barreras oceanográficos costeros que producen retención larval. Por útlimo se se analizó una serie temporal de 15 años en 3 localidaes para determinar cuales son los factores (exógenos o endógenos) que explican la dinámica de las poblaciones. Como resultado fue posible generar modelos simples para ambas especies y corroborar lo encontrado en el análisis genético en cuanto a la escala en que se pueden individualizar poblaciones.
El lobo marino común, Otaria flavescens, en Chile: distribución espacial, historia demográfica y estructuración genética.
(2013) Weinberger Illanes, Constanza Susana; Marquet, P. A. (Pablo A.); Faugeron, Sylvain Wielfrid; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Otaria flavescens se encuentra ampliamente distribuida en America del Sur, donde ha sido objeto de explotación indiscriminada, llevando a la especie a drásticas fluctuaciones poblacionales durante el siglo pasado. Actualmente, la especie se encuentra protegida por ley. Sin embargo, debido a sus hábitos alimenticios, la especie interfiere con las actividades de pesca extractiva, existiendo una presión constante por parte de los pescadores por la apertura de la veda. A esta presión antropogénica se suma los efectos de fluctuaciones ambientales decadales, principalmente del ENSO. Debido a esto, se requiere establecer estrategias de manejo de largo plazo para la especie. El comportamiento reproductivo de O. flavescens, al igual que en otros otáridos, se encuentra determinado por la existencia de reproducción anual con agregación reproductiva, y un posible trade-off entre los costos y beneficios de la filopatría y la dispersión. Este patrón determina la estructuración espacial de la especie, dominada por el comportamiento metapoblacional. Así, para el manejo de O. flavescens, se debe considerar su estructura espacial así como su dinámica metapoblacional. Adicionalmente, el entendimiento de los efectos antropogénicos y ambientales en el pasado, permite predecir cambios demográficos futuros. En esta tesis se pretendió responder a diversas preguntas sobre la estructura y dinámica metapoblacional de O. flavescenes, así como sobre su demografía histórica. Se evaluó la filogeografía de O. flavescens, así como la demografía histórica en Chile, mediante el análisis de secuencias de la región control del ADN mitocondrial. Igualmente, se determinaron patrones comunes de demografía histórica en otáridos. El segundo capítulo abarcó la estructuración genética de la especie en Chile, así como los efectos demográficos de la caza y de los eventos ENSO, mediante el uso de marcadores microsatellitales y de frecuencias alélicas de la región control de mtDNA. El tercer capítulo se basó en el análisis de la distribución espacial de la especie en Chile, con un enfoque en conservación y manejo. Para esto se evaluaron los resultados de los dos censos completos de la especie, analizando la distribución espacial de abundancias mediante el uso de teoría de grafos y tomando en cuenta las estimaciones de distancias de dispersión de la especie, determinadas mediante análisis de autocorrelación espacial de abundancias. El análisis del mtDNA (n=72) muestra la existencia de dos clados filogenéticos para la especie, un clado en el océano Atlántico y otro en el océano Pacífico. Cada uno de estos clados presenta adaptación particulares, por lo que enfrentan el cambio global de forma diferenciada. En el Estrecho de Magallanes se encontraron individuos pertenecientes a ambos clados, representando una zona de mezcla particularmente susceptible a efectos ambientales y antropogénicos debido al bajo tamaño poblacional. El tiempo estimado de divergencia entre ambos clados fue de 77.441-79.828 años antes del presente, consistente con las características ambientales durante el Último Período Glacial. La evidencia genética sugiere que O. flavescens experimientó una expansión demográfica aproximadamente hace 13.000 años antes del presente, acorde con el fin del Último Máximo Glacial. Este resultado concuerda con lo señalado por otro autores para la especie en el Atlántico, así como para la mayoría de las especies de otáridos, sugiriendo condiciones climáticas favorables para el taxa a nivel global. Por otro lado, los resultados de ocho loci microsatelitales (n=63) muestran la existencia de dos clusters genéticos separados aproximadamente a 41°S, representando dos Unidades de Manejo (MU), consistentes con el mayor quiebre oceanográfico y biogeográfico de la costa Pacífico Sur. No se obtuvo registros de un cuello de botella genético, con valores de Ne por encima del valor mínimo viable descrito para vertebrados (Ne norte = 12.320, Ne sur =7.475 individuos). A pesar de esto, los valores de la razón Ne/N encontrado para la MU sur (0,229) se encuentra por debajo del rango normal descrito para especies silvestres (0,25-0,75) y para la MU norte esta razón Ne/N (0,296) se encuentra en el límite inferior del rango, advirtiendo sobre la vulnerabilidad de sus poblaciones. Por otro lado, el análisis de autocorrelación espacial de abundancias mostró una disminución de la autocorrelación entre colonias ubicadas a distancias mayores a 100 km, consistente con la distancia de forrajeo registrada para la especie. A pesar de esto, el análisis de parentesco no mostró relación con la distancia geográfica, no pudiendo descartarse la existencia de dispersión tipo "stepping stone". La distribución espacial de abundancias, así como el efecto de la distancia entre colonias sobre la conectividad de la red espacial, corroboran la presencia de un quiebre en la distribución de la especie a ~40°S, confirmando la existencia de 2 metapoblaciones o Unidades de Manejo. Estos resultados muestran también un cambio en la distribución de abundancias y en la conectividad por distancia a ~30°S, acorde con cambios en los regimenes de surgencia. La distribución espacial de O. flavescens en Chile mostró depender de la presencia de varias colonias distribuidas a lo largo del país, y por lo tanto de importancia para la persistencia de sus metapoblaciones. A pesar de que las condiciones genéticas y demográficas de O. flavescens no representan un problema poblacional actual en Chile, la explotación de la especie, con el fin de mitigar la interferencia de la misma con la pesquería, debe ser tomado con cautela. Esto debido a la dependencia de las poblaciones del lobo marino con la abundancia de recursos, en conjunto con el declive, durante las últimas décadas, de las poblaciones de algunas presas representativas de la dieta de O. flavescens por la industria pesquera, y por la dependencia de la dinámica poblacional de la especie a las condiciones climáticas.
Tempo y modo de la radiación de roedores neotropicales sigmodontinos.
(2013) Parada Rodríguez, Andrés; Palma Vásquez, Ramón Eduardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La subfamilia de roedores Sigmodontinae (Rodentia, Cricetidae) con cerca de 400 especies reconocidas, es uno de los grupos de mamíferos neotropicales más diverso y ampliamente distribuido. El contexto ecológico parece esencial para entender la evolución de este grupo. Estos roedores han proliferado abundantemente ocupando una gran variedad de hábitats y estilos de vida. Para entender el escenario histórico en el cual floreció este grupo, mediante el análisis de secuencias de ADN se estimaron los tiempos de divergencia de los principales linajes y del ancestro común más reciente de Sigmodontinae empleando relojes moleculares. Se estimó un origen de Sigmodontinae en el Mioceno medio (cerca de 12 en el pasado), mientras que la mayoría de las tribus habrían diversificado durante el Mioceno tardío. Estos resultados junto a la reconstrucción de áreas ancestrales han facilitado entender la evolución de Sigmodontinae.Este grupo se habría originado en la región del Caribe y luego de su entrada en Sudamérica diversificó profusamente. La “oportunidad ecológica” (i.e. abundancia de recursos accesibles) es usualmente considerada como desencadenante del acúmulo de riqueza de especies excepcional en algunos taxa. Se evaluó su influencia en la diversificación de los sigmodontinos examinando la asociación entre el hábitat ocupado y las tasas de especiación inferidas en distintos linajes. Se detectaron varios cambios de tasa de diversificación en varios linajes (ej. dentro de Akodontini). Los resultados sugieren una correlación hábitat ocupado y las tasas de especiación. En un marco más general, se considera que eventos o condiciones locales pueden haber facilitado el acceso a recursos para estos roedores y cómo esto puede haber influido en la proliferación -o falta de ésta- en algunos grupos dentro de la Subfamilia. Se realizó una breve revisión de aquellos mecanismos explicativos de patrones de riqueza de especies que serían útiles para entender la diversidad sigmodontina. Explicaciones como la influencia del “determinismo local” o la “zona ecológica de origen” parecen marcos promisorios para entender la radiación de este grupo. A modo de conclusión, la aparición de nuevos hábitats, sumado a cambios geológicos y en vegetación durante el Mioceno/Plioceno habrían promovido la diversificación de Sigmodontinae.
Quorum sensing and 3-indole acetic acid degradation play a role in colonization and plant growth promotion of Arabidopsis thaliana by Burkholderia phytofirmans.
(2013) Zúñiga Sepúlveda, Ana Angélica; González Ojeda, Bernardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La comunicación molecular en la rizósfera tiene un importante papel en la regulación de rasgos que caracterizan la asociación planta-bacteria. Burkholderia phytofirmans PsJN es una bacteria promotora del crecimiento de plantas (PGPR) bien caracterizada y capaz de establecer interacciones rizosféricas y endofíticas con diferentes especies de plantas. Para una efectiva promoción del crecimiento es necesario que las PGPR tengan una colonización competente del hospedero. Utilizando cepas mutantes de B. phytofirmans PsJN en los sistemas de quorum sensing, se obtuvo evidencia sobre la importancia de la comunicación célula a célula para una colonización eficiente de plantas de Arabidopsis thaliana y para el establecimiento de una interacción benéfica. Además, se observó que la degradación de la auxina ácido 3-indolacético (AIA) tiene un rol clave en la promoción del crecimiento de plantas y es necesaria para una colonización eficiente. La cepa silvestre de PsJN pero no la mutante iacC, incapaz de degradar AIA, puede reestablecer los efectos de promoción en las raíces de A. thaliana en presencia de AIA exógeno, indicando la importancia de esta característica en la promoción del crecimiento de la raíz primaria.
Estrategias funcionales contrastantes en el género Nolana (Solanaceae) y su importancia en la respuesta a las fluctuaciones climáticas actuales y pasadas /
(2013) Ossa Zazzali, Paulina Gabriela; Pérez Trautmann, María Fernanda; Armesto, Juan J.; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La historia climática, la historia de vida y la ecología se conjugan para dar cuenta de la respuesta de las plantas a las variaciones del ambiente. La respuesta ecológica de las plantas apunta a optimizar el ajuste con el ambiente; así, en un gradiente ambiental, la interacción con el ambiente dará cuenta de un espectro de variación en rasgos funcionales correlacionados que explican distintas estrategias funcionales. Esta interacción con el ambiente ha dejado una huella genética en las poblaciones de plantas y su filogeografía en respuesta a las fluctuaciones climáticas pasadas. En esta tesis se desarrolló una aproximación actual (ecológica) e histórica (filogeografía) para entender el rol de los rasgos funcionales (ecofisiológicos y de historia de vida) en la respuesta de las plantas a las fluctuaciones del clima.Se utilizó como modelo de estudio dos linajes del género Nolana, endémico del Desierto de Atacama, co-distribuidos en la costa a lo largo del abrupto gradiente de precipitaciones desde el sur del Desierto de Atacama a la región mediterránea de Chile central. Los linajes estudiados fueron categorizados de acuerdo a sus rasgos funcionales de planta completa (historia de vida, forma de vida y forma de crecimiento) en: linaje herbáceo, comprendida por N. rupicola, N. acuminata, N. reichei, N. paradoxa; todas plantas herbáceas de ciclo de vida corto, hermanas en la filogenia y distribuidas secuencialmente en el gradiente ambiental. El segundo grupo, identificado como linaje arbustivo, comprendido por N. incana y N. crassulifolia, ambas arbustos siempreverdes de ciclo de vida largo, estrechamente emparentadas y distribuidas secuencialmente en el gradiente ambiental. Para indagar en las estrategias funcionales utilizadas y la capacidad de ajuste de estos grupos de plantas, se estudió la variación de rasgos foliares (morfológicos y eco fisiológicos) a lo largo del gradiente de precipitaciones en el rango geográfico compartido. se estudiaron los patrones filogeográficos de ambos linajes a lo largo de todo el rango de distribución latitudinal a partir de la secuenciación de dos fragmentos de ADN cloroplastidiales.Los resultados de esta Tesis muestran que estos dos linajes responden a estrategias contrastantes a lo largo de todo el gradiente, observándose una estrategia de conservación de agua por parte de las arbustivas y una estrategia de captura de recursos por parte de las herbáceas. Ambas estrategias fueron mantenidas a lo largo del gradiente, ajustando la variación en rasgos asociados a cada estrategia; mientras las arbustivas regulan principalmente el tamaño de los estomas y mantienen elevada relación masa por área, las herbáceas, regulan además la densidad estomática y mantienen elevado contenido de nitrógeno (asociado a mayor capacidad fotosintética en las hojas). En cuanto a la respuesta histórica, ambos grupos respondieron a las fluctuaciones climáticas durante el Cuaternario con signos de expansión de rango hacia el sur, pero con distintos patrones de estructuración filogeográfica y rango alcanzado.En base a los resultados de esta tesis se puede concluir que estos dos grupos de Nolana corresponden a dos estrategias funcionales contrastantes lo que influye en su desempeño a lo largo de un gradiente ambiental y afectó su respuesta a las fluctuaciones climáticas pasadas. Se demuestra la importancia de los rasgos funcionales (historia de vida y morfoecofisiológicos) en la respuesta de las plantas a las fluctuaciones ambientales, haciendo hincapié en la influencia de la historia de vida (forma, ciclo de vida) en la capacidad de respuesta ecológica, ajuste al ambiente y en la respuesta histórica a las fluctuaciones climáticas pasadas
C-ABL estabiliza los niveles de HDAC2 por fosforilación en tirosina reprimiendo la expresión de genes neuronales en la enfermedad de Alzheimer.
(2014) González Zúñiga, Marcelo Andrés; Álvarez Rojas, Alejandra; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo caracterizado por un deterioro cognitivo progresivo. El sello distintivo de los cerebros afectados con la enfermedad de Alzheimer es la presencia de agregados proteicos insolubles. En este sentido, la hipótesis de la cascada del amiloide plantea que la acumulación y agregación del péptido A\03B2 desencadena un conjunto de mecanismos que conducen a la disfunción y la apoptosis de las neuronas. Entre los mecanismos descritos, uno que ha despertado gran interés es la disminución en la expresión de genes neuronales producto del incremento en los niveles de HDAC2. Esta enzima cataliza la deacetilación de las histonas, lo que provoca que la cromatina adquiera una conformación cerrada que es transcripcionalmente inactiva. Actualmente, la evidencia indica que HDAC2 esta involucrada en el deterioro cognitivo y en la disfunción sináptica que caracteriza a la EA. A pesar de que se ha descrito extensamente que el incremento en los niveles de HDAC2 tiene un papel negativo en el desarrollo de la EA, los mecanismos moleculares involucrados en este incremento no están completamente dilucidados. Interesantemente, se ha demostrado en modelos in vitro que la tirosina quinasa c-Abl esta implicada en la represión de genes por un mecanismo epigenético, el cual sería dependiente de la actividad de las HDACs. En neuronas, la tirosina quinasa c-Abl es un actor clave en los procesos neurodegenerativos. En efecto, resultados de nuestro laboratorio han demostrado que la c-Abl es activada y participa en la muerte neuronal, la disfunción y la pérdida sináptica en modelos de la EA.
Estudio de los genes VvBSL1 y VvBSL2, que codifican para putativos factores de transcripción, en la respuesta a estrés en Vitis vinifera L.
(2014) Serrano Acevedo, Jennyfer Scarlett; Arce Johnson, Jorge Patricio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Vitis vinifera L., es una especie extensivamente cultivada a lo largo de Chile y está expuesta a condiciones de estrés biótico y abiótico muy diversas. Parte importante de los mecanismos adaptativos que permiten a las plantas responder a estrés dependen de cambios transcripcionales. En esta tesis se identificaron dos genes pertenecientes a la familia de factores de transcripción R2R3MYB en V. vinifera, nombrados como VvBSL1 y VvBSL2 por su alta homología con genes de otras especies relacionados a la respuesta tanto a estrés biótico como abiótico. Utilizando RT-PCR en tiempo real, se determinó que VvBSL1 es inducido tanto por la infección por Botrytis cinerea, Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3) y salinidad. Esto sugiere que VvBSL1 podría constituir un punto de convergencia para la respuesta a estrés biótico y abiótico. Adicionalmente, los niveles de transcrito de VvBSL2 son aumentados en estrés abiótico como elevada radiación UV-B y salinidad.
Lipopolisacárido afecta el transporte mucociliar alterando el mecanismo de liberación de ATP que regula la actividad ciliar en las vías respiratorias de ratón
(2014) Carreño Bustos, Daniela Verónica; Villalón, Manuel J.; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
En el epitelio mucociliado, la eficiencia del transporte mucociliar (TMC) es determinada por la frecuencia de batido ciliar (FBC) y la actividad coordinada del movimiento de los cilios. Señales químicas producidas localmente por el epitelio como el adenosin trifosfato (ATP), pueden modificar la actividad ciliar del epitelio respiratorio, por su interacción con los receptores purinergicos P2Y. Lipopolisacarido (LPS) un componente de la pared bacteriana, un conocido agente inflamatorio, cuyos efectos están mediados por el receptor TLR4, sin embargo hay poca evidencia sobre los efectos de LPS sobre la actividad ciliar y los mecanismos de liberación de ATP en epitelio respiratorio. Para estudiar el efecto de LPS en la actividad ciliar y las vías de señalización involucradas, utilizamos cultivos primarios de epitelio ciliado de tráquea de ratón. La FBC fue determinada mediante videomicroscopia y el ATP extracelular fue medido mediante el ensayo de luceferin luciferasa, en condiciones control y en presencia de fármacos antagonistas e inhibidores de las distintas vías de señalización. También determinamos la velocidad de transporte mucociliar por el movimiento de las microesferas sobre el epitelio de la tráquea.En este estudio, determinamos que LPS incrementa la FBC y la velocidad de transporte de las microesferas. El incremento en la FBC está asociado a un incremento en ATP extracelular. El incremento de la FBC fue bloqueado mediante el uso de apirasa, enzima que hidroliza el ATP extracelular. La participación de la vía de señalización TLR fue evaluado en el efecto de LPS sobre la FBC. Mediante PCR e inmunofluorescencia detectamos la expresion del receptor TLR4 en los cultivos primarios. Antagonistas de NF-κB no lograron bloquear el incremento de la FBC inducido por LPS, sugiriendo que la activación de este factor de transcripción no participa en el incremento de la FBC.Usando antagonistas de receptores purinergicos P2X7 (P2X7R) y Panexina 1 (Panx1), determinamos que ambos participan en el mecanismo de liberación de ATP inducido por LPS. Adicionalmente, establecimos mediante el ensayo de captación de colorante, que LPS induce apertura de Panx1. Un quelante de Ca2+, BAPTA-AM bloquea el incremento en la FBC y la liberación de ATP inducido por LPS. Antagonistas específicos de la vía de señalización P2Y, bloquean el incremento en la FBC inducido por LPS. Estos resultados sugieren que LPS induce liberación de ATP al extracelular por un mecanismo que involucra la participación de Panx1 y P2X7R y luego este ATP activa la vía de señalización mediada por la vía de señalización P2Y. En conclusión, nuestros resultados demuestran que LPS es una señal química que participa en la regulación de la actividad del batido ciliar, aumentando la FBC y la velocidad del transporte mucociliar en células ciliadas de tráquea de ratón. Estos resultados dan evidencias del mecanismo por el cual factores ambientales pueden inducir una respuesta fisiológica funcional que afecta el clearance mucociliar.
Rol del sistema interoceptivo en el miedo condicionado.
(2014) Madrid Gómez, Carlos Andrés; Torrealba, Fernando; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La región interoceptiva de la corteza insular es responsable de monitorear continuamente las condiciones fisiológicas internas, por lo que sería una región clave para la elaboración de respuestas conductuales consistentes con las necesidades internas del organismo. Asímismo, la amplia red de conexiones con estructuras autonómicas, viscerales y límbicas, como las fuertes y reciprocas conexiones con los núcleos amigdalinos, sugiere que esta corteza desempeña un importante papel en la integración de funciones autonómicas y emocionales que subyacen a la expresión de conductas complejas. La amígdala, una región que presenta abundantes y recíprocas conexiones con la corteza insular, se la ha señalado ampliamente como una estructura clave en el procesamiento de estímulos emocionales y en la formación de memoria emocional, particularmente en las memorias asociadas a miedo. De acuerdo a estos antecedentes nosotros proponemos que la desconexión entre el sistema interoceptivo y la amígdala alteran el aprendizaje del miedo condicionado. Primero, por medio de la inyección de trazadores anterógrado (BDA) y uno retrógrado (CTB), definimos cuatro subregiones de la corteza insular granular describiendo además el flujo de información interoceptiva hacia la RAIC.
BZIP transcription factors and transcriptional regulatory networks in the neurospora circadian system
(2014) Montenegro Montero, Alejandro Esteban; Larrondo Castro, Luis Fernando; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Circadian clocks are endogenous cellular timekeepers that confer daily rhythms to a large number of biological processes. These clocks are present in various organisms across different evolutionary lineages, in which they regulate close to 24-hours rhythms in gene expression, physiology and behavior, enabling individuals to anticipate predictable environmental variations. The ascomycete Neurospora crassa has played a key role in the unveiling of the molecular and genetic basis of these time-telling machineries. In Neurospora, as in other eukaryotes, the integration of a series of cellular and molecular processes gives rise to a robust cell-based pacemaker, capable of coordinating rhythmic control of several aspects of their biology. Although a detailed molecular description of the core oscillator or pacemaker is now possible in model eukaryotes, there is limited information on the mechanisms that allow it to regulate rhythmic processes. Such “output pathways”, the circuits through which the pacemaker endows different processes with rhythmicity, are the least characterized aspect of circadian systems. In Neurospora, a hierarchical arrangement of transcriptional regulators has been proposed as the main mechanism through which the clock regulates rhythmic gene expression.The different actors involved in such time relay, connecting the oscillator with overt rhythms, are however largely unknown. In addition, despite decades as a research model organism, little is known about transcriptional regulatory networks in this fungus and the vast majority of transcription factors in Neurospora remain uncharacterized. In an effort to improve current knowledge of output pathways, the most neglected aspect of circadian biology, in a clock model system and study transcriptional regulatory networks in a model eukaryote, we set out to characterize the bZIP family of transcriptional regulators in Neurospora, in the context of its circadian system. We report a complete revision of the list of sequence-specific DNA-binding proteins in this fungus, which resulted in the identification of several novel ones, including many bZIP proteins. As the few transcription factors that have been associated with output pathways in Neurospora have been shown to exhibit clock input, we evaluated whether the expression of bZIP encoding genes in this organism is under control of the circadian clock. By using a luciferase-based, high-throughput screening system, we identified several bZIP encoding genes whose expression is regulated by the circadian pacemaker. A major limitation in the study of transcriptional regulatory networks in Neurospora, such as those underlying clock regulated transcription, stems from the fact that little is known about the sequence preference of its transcription factors. With the goal of identifying and characterizing transcriptional regulatory networks in which the putative Neurospora transcription factors participate, we employed double-stranded DNA microarrays known as protein-binding microarrays, to determine the sequence preference of Neurospora transcription factors.Such an approach allows for rapid, high-throughput and unbiased characterization of the sequence specificity of DNA-binding proteins. This resulted in the determination of the sequence preference of over half of Neurospora predicted transcription factors, information that together with the various molecular tools available in Neurospora, led to the identification of a rhythmically expressed bZIP transcription factor, ADA-1, as a regulator of output pathways in Neurospora, controlling various output genes. In addition, this information allowed for the evaluation of the role of another bZIP transcription factor, ASL-1, in such pathways. Notably, this is the first report aimed at studying DNA-binding specificities on a global scale in the fungal kingdom outside of the yeast clade, representing a powerful resource for the study of transcriptional regulatory networks in filamentous fungi, the largest group within the fungal kingdom. Indeed, through the use of these data we identified, for the first time, a transcription factor that is required for growth under osmotic stress in Neurospora. Lastly, we report on the identification of a novel process involved in output pathways in Neurospora, namely cell fusion pathways, and we herein show it to be necessary for proper rhythms in a number of genes, including bZIP encoding genes. As a whole, the work reported in this Thesis, represents a major advancement in the study of bZIP proteins and transcriptional regulatory networks in Neurospora.

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