3.06 Tesis doctorado

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Análisis de los cambios tempranos del transcriptoma en respuesta al daño en la médula espinal de Xenopus laevis.
(2019) Peñailillo Lazo, Johany Freddy; Larraín Correa, Juan Agustín; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
A diferencia de los mamíferos, otros animales como las larvas de anfibios anuros (donde se incluye a Xenopus) pueden lograr una recuperación funcional completa después de una lesión en la médula espinal. En nuestro laboratorio, se ha establecido a la rana Xenopus laevis (X. laevis) como un organismo modelo para estudiar la regeneración de la médula espinal. Una de las principales ventajas de X. laevis es que las larvas en etapas 50-54 (estadios-R) pueden recuperarse anatómica, histológica y funcionalmente después de una lesión en la médula espinal (LME). Esas habilidades se pierden por completo en las ranas juveniles (estadio-NR). La zona ependimaria del canal central de la médula espinal de las larvas en estadios-R presenta un alto porcentaje de células progenitoras neuronales (NPC) Sox2+. Estas se activan rápidamente en respuesta a una lesión y son necesarias para lograr la regeneración completa de la médula espinal. Nuestro interés es identificar las redes genéticas y las vías de señalización involucradas en la activación temprana de NPC. Para identificar los mecanismos y las vías de señalización involucradas en la activación de células Sox2+, hemos realizado un análisis de los cambios del transcriptoma durante las primeras 21 horas posteriores a la transección (hpt) en animales en estadios-R. Con este objetivo, el tejido del sitio de la lesión se aisló cada 1 hora luego de la lesión en animales transectados, así como también en animales control, con daño simulado (sham) y sin daño. Como resultado de este muestreo y posterior secuenciación de ARNm conseguimos más de 100 librerías de RNA-seq, con las cuales se realizó un exhaustivo análisis bioinformático. Los genes expresados diferencialmente (GEDs) se identificaron mediante Procesos Gaussianos. Posteriormente, la estructura modular de los GEDs se infirió utilizando un Análisis de redes de Co-expresión Génica Ponderada (WGCNA). Estos módulos de co-expresión fueron analizados buscando procesos biológicos y vías de señalización KEGG enriquecidas. Además, analizamos los motivos de unión al ADN de factor de transcripción enriquecidos en el promotor proximal de genes coexpresados y las interacciones proteína-proteína entre los GEDs. Identificamos 1850 GEDs que se agruparon en 11 módulos de coexpresión (3 regulados negativamente, 2 regulados positivamente con una activación inmediata, 3 regulados positivamente con una activación intermedia y 3 regulados positivamente con una activación tardía). El análisis de ontología génica reportó: (1) un enriquecimiento de los reguladores negativos de la señalización mTOR en los primeros módulos regulados negativamente, (2) un aumento en factores de transcripción en los módulos de activación inmediata, (3) un aumento en los componentes de la biogénesis del ribosoma en módulos de activación intermedia y (4) un aumento en genes asociados a división de células progenitoras y de ciclo celular en módulos de activación tardía. En base a nuestros análisis bioinformáticos decidimos estudiar el rol de la vía mTOR durante las primeras horas luego de la transección. Análisis por Western Blot e Inmunofluorescencia contra p-S6, la forma activa de un componente intracelular de la vía mTOR, mostraron una activación rápida a las 3 hpt y principalmente en las células de la zona ependimaria del canal central cercanas al sitio de la lesión y los cuerpos neuronales a lo largo del sistema nervioso. La inhibición de esta vía de señalización utilizando rapamicina bloquea la proliferación de células Sox2+ y la recuperación funcional después de la LME. Estos resultados sugieren un papel clave para la vía mTOR en la rápida activación de las células Sox2+ para una adecuada recuperación después de la LME en renacuajos. De esta manera, podemos concluir que identificamos cambios tempranos en el transcriptoma de la médula espinal en respuesta al daño a la médula espinal, los cuales pueden ser asociados a varios procesos biológicos y vías de señalización que se despliegan en ondas transcripcionales secuenciales después de la LME. Finalmente, análisis bioinformáticos y pruebas funcionales de la vía mTOR sugieren que esta vía de señalización sería clave durante las primeras horas de la regeneración de la médula espinal.
C-ABL estabiliza los niveles de HDAC2 por fosforilación en tirosina reprimiendo la expresión de genes neuronales en la enfermedad de Alzheimer.
(2014) González Zúñiga, Marcelo Andrés; Álvarez Rojas, Alejandra; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo caracterizado por un deterioro cognitivo progresivo. El sello distintivo de los cerebros afectados con la enfermedad de Alzheimer es la presencia de agregados proteicos insolubles. En este sentido, la hipótesis de la cascada del amiloide plantea que la acumulación y agregación del péptido A\03B2 desencadena un conjunto de mecanismos que conducen a la disfunción y la apoptosis de las neuronas. Entre los mecanismos descritos, uno que ha despertado gran interés es la disminución en la expresión de genes neuronales producto del incremento en los niveles de HDAC2. Esta enzima cataliza la deacetilación de las histonas, lo que provoca que la cromatina adquiera una conformación cerrada que es transcripcionalmente inactiva. Actualmente, la evidencia indica que HDAC2 esta involucrada en el deterioro cognitivo y en la disfunción sináptica que caracteriza a la EA. A pesar de que se ha descrito extensamente que el incremento en los niveles de HDAC2 tiene un papel negativo en el desarrollo de la EA, los mecanismos moleculares involucrados en este incremento no están completamente dilucidados. Interesantemente, se ha demostrado en modelos in vitro que la tirosina quinasa c-Abl esta implicada en la represión de genes por un mecanismo epigenético, el cual sería dependiente de la actividad de las HDACs. En neuronas, la tirosina quinasa c-Abl es un actor clave en los procesos neurodegenerativos. En efecto, resultados de nuestro laboratorio han demostrado que la c-Abl es activada y participa en la muerte neuronal, la disfunción y la pérdida sináptica en modelos de la EA.
Disfunción vascular inducida por la liberación de CGRP desde los nervios sensoriales perivasculares.
(2015) Gaete Pauchard, Pablo Simón; Figueroa, Xavier; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La regulación de la presión arterial y de la distribución del flujo sanguíneo depende del control del grado de contracción del músculo liso (i.e. tono vasomotor) que recubre las arterias de resistencia. Además del músculo liso, la pared de estos vasos está compuesta por una capa de células endoteliales, las cuales controlan el tono vasomotor mediante la liberación de agentes vasodilatadores, principalmente, el óxido nítrico (NO) y el factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF). Las células de la pared vascular están conectadas entre sí por canales intercelulares formados por conexinas, los cuales transmiten el NO y el EDHF a las células musculares lisas adyacentes y permiten la coordinación de la función vascular. Las conexinas también forman hemicanales, los cuales conectan el compartimiento intracelular con el espacio extracelular. La panexina-1 (Panx-1) forma canales estructuralmente similares a los hemicanales formados por las conexinas. Interesantemente, la activación de ambos, los hemicanales formados por conexinas o los canales de Panx-1, ha sido ampliamente asociada a procesos inflamatorios y a disfunción celular. Las arterias de resistencia están inervadas por fibras sensoriales sensibles a capsaicina que liberan el péptido relacionado al gen de la calcitonina (CGRP) durante condiciones inflamatorias. Notablemente la inflamación conduce a la reducción de la vasodilatación dependiente del NO y del EDHF; no obstante, los mecanismos que median este fenómeno se desconocen. Basado en estos antecedentes, la hipótesis de este trabajo es que el CGRP induce la activación de los canales de Panx-1 en el endotelio vascular, lo cual conduce a la pérdida de la señalización del NO y a la inhibición del acoplamiento intercelular mediado por uniones comunicantes.
Effect of hypoxia in skeletal muscle fibrosis : regulation of CTGF/CCN2 expression by HIF-1α and TGF-β.
(2019) Valle Tenney, Roger Christian; Brandan, Enrique; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La fibrosis es una condición recurrente en varias patologías asociadas al músculo esquelético entre ellas: la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), diferentes patologías neuromusculares como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) o aquellas asociadas a denervación, y en daño crónico. La fibrosis muscular se caracteriza por la acumulación excesiva de proteínas de matriz extracelular (ECM), inflamación persistente, daño muscular y sobreexpresión de factores profibróticos. Entre estos últimos se encuentran; el factor de crecimiento transformante tipo β (TGF-β) y el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF/CCN2). Varios antecedentes muestran que músculos fibróticos también están asociados a un daño vascular. Resultados preliminares de nuestro laboratorio en modelos murinos que desarrollan fibrosis muestran una disminución en la cantidad de capilares que rodean las fibras musculares. En consecuencia, esto se asocia a una disminución en la perfusión sanguínea y por lo tanto a una disminución en la tensión de oxígeno en el tejido. Este fenómeno se define como hipoxia y lleva a la activación de mecanismos moleculares de respuesta que promueven la supervivencia celular y adaptación a bajas concentraciones de oxígeno. Sin embargo, la relación entre hipoxia y fibrosis no ha sido estudiada en el músculo esquelético. El factor transcripción inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) es el regulador central de la respuesta molecular a hipoxia, mientras que CTGF/CCN2 es una proteína matricelular clave en la inducción de la fibrosis. Existe evidencia previa que vincula la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y específicamente HIF-1α, de manera opuesta en distintos tejidos. Sin embargo, no está descrito como hipoxia regula la expresión de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético. El objetivo de esta tesis es estudiar el mecanismo molecular y las vías de señalización involucradas en la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y TGF-β en distintos tipos celulares que componen el músculo esquelético in vitro e in vivo. Para este análisis sometimos sistemáticamente fibroblastos, mioblastos y miotubos, de líneas celulares y cultivo primario, a condiciones de hipoxia en una cámara de cultivo con atmosfera controlada junto con estimulación con TGF-β. En primer lugar, encontramos que los tratamientos a distintos tiempos en atmosfera hipóxica no indujeron la expresión de CTGF/CCN2 en ninguno de los tipos celulares mencionados anteriormente. Interesantemente, encontramos que específicamente los miotubos sobreexpresan CTGF/CCN2 tras la activación conjunta de la ruta de señalización de hipoxia mediada por HIF-1α y TGF-β. Describimos que el efecto de ambas rutas sobre la expresión de CTGF/CCN2 es de tipo sinérgico, depende del factor de transcripción HIF-1α y requiere de las rutas de señalización no canónicas de TGF-β. Finalmente, probamos estos resultados in vivo utilizando 2 metodologías para activar la ruta señalización de hipoxia mediada por HIF-1α: mediante estabilizadores farmacológicos de HIF-1α y a través de isquemia por escisión de la arteria femoral. Combinamos estas metodologías con inyecciones intramusculares de TGF-β y logramos recapitular el efecto observado in vitro. Tras la activación farmacológica de HIF-1α y la inyección intramuscular de TGF-β observamos un efecto sinérgico en la expresión de CTGF/CCN2 y dicha expresión se encontró localizada en las fibras musculares in vivo. En base a esto postulamos que las fibras musculares son la principal fuente de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético en respuesta a hipoxia y TGF-β; y contribuyen a la progresión de la patología fibrótica.La fibrosis es una condición recurrente en varias patologías asociadas al músculo esquelético entre ellas: la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), diferentes patologías neuromusculares como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) o aquellas asociadas a denervación, y en daño crónico. La fibrosis muscular se caracteriza por la acumulación excesiva de proteínas de matriz extracelular (ECM), inflamación persistente, daño muscular y sobreexpresión de factores profibróticos. Entre estos últimos se encuentran; el factor de crecimiento transformante tipo β (TGF-β) y el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF/CCN2). Varios antecedentes muestran que músculos fibróticos también están asociados a un daño vascular. Resultados preliminares de nuestro laboratorio en modelos murinos que desarrollan fibrosis muestran una disminución en la cantidad de capilares que rodean las fibras musculares. En consecuencia, esto se asocia a una disminución en la perfusión sanguínea y por lo tanto a una disminución en la tensión de oxígeno en el tejido. Este fenómeno se define como hipoxia y lleva a la activación de mecanismos moleculares de respuesta que promueven la supervivencia celular y adaptación a bajas concentraciones de oxígeno. Sin embargo, la relación entre hipoxia y fibrosis no ha sido estudiada en el músculo esquelético. El factor transcripción inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) es el regulador central de la respuesta molecular a hipoxia, mientras que CTGF/CCN2 es una proteína matricelular clave en la inducción de la fibrosis. Existe evidencia previa que vincula la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y específicamente HIF-1α, de manera opuesta en distintos tejidos. Sin embargo, no está descrito como hipoxia regula la expresión de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético. El objetivo de esta tesis es estudiar el mecanismo molecular y las vías de señalización involucradas en la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y TGF-β en distintos tipos celulares que componen el músculo esquelético in vitro e in vivo. Para este análisis sometimos sistemáticamente fibroblastos, mioblastos y miotubos, de líneas celulares y cultivo primario, a condiciones de hipoxia en una cámara de cultivo con atmosfera controlada junto con estimulación con TGF-β. En primer lugar, encontramos que los tratamientos a distintos tiempos en atmosfera hipóxica no indujeron la expresión de CTGF/CCN2 en ninguno de los tipos celulares mencionados anteriormente. Interesantemente, encontramos que específicamente los miotubos sobreexpresan CTGF/CCN2 tras la activación conjunta de la ruta de señalización de hipoxia mediada por HIF-1α y TGF-β. Describimos que el efecto de ambas rutas sobre la expresión de CTGF/CCN2 es de tipo sinérgico, depende del factor de transcripción HIF-1α y requiere de las rutas de señalización no canónicas de TGF-β. Finalmente, probamos estos resultados in vivo utilizando 2 metodologías para activar la ruta señalización de hipoxia mediada por HIF-1α: mediante estabilizadores farmacológicos de HIF-1α y a través de isquemia por escisión de la arteria femoral. Combinamos estas metodologías con inyecciones intramusculares de TGF-β y logramos recapitular el efecto observado in vitro. Tras la activación farmacológica de HIF-1α y la inyección intramuscular de TGF-β observamos un efecto sinérgico en la expresión de CTGF/CCN2 y dicha expresión se encontró localizada en las fibras musculares in vivo. En base a esto postulamos que las fibras musculares son la principal fuente de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético en respuesta a hipoxia y TGF-β; y contribuyen a la progresión de la patología fibrótica.La fibrosis es una condición recurrente en varias patologías asociadas al músculo esquelético entre ellas: la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), diferentes patologías neuromusculares como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) o aquellas asociadas a denervación, y en daño crónico. La fibrosis muscular se caracteriza por la acumulación excesiva de proteínas de matriz extracelular (ECM), inflamación persistente, daño muscular y sobreexpresión de factores profibróticos. Entre estos últimos se encuentran; el factor de crecimiento transformante tipo β (TGF-β) y el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF/CCN2). Varios antecedentes muestran que músculos fibróticos también están asociados a un daño vascular. Resultados preliminares de nuestro laboratorio en modelos murinos que desarrollan fibrosis muestran una disminución en la cantidad de capilares que rodean las fibras musculares. En consecuencia, esto se asocia a una disminución en la perfusión sanguínea y por lo tanto a una disminución en la tensión de oxígeno en el tejido. Este fenómeno se define como hipoxia y lleva a la activación de mecanismos moleculares de respuesta que promueven la supervivencia celular y adaptación a bajas concentraciones de oxígeno. Sin embargo, la relación entre hipoxia y fibrosis no ha sido estudiada en el músculo esquelético. El factor transcripción inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) es el regulador central de la respuesta molecular a hipoxia, mientras que CTGF/CCN2 es una proteína matricelular clave en la inducción de la fibrosis. Existe evidencia previa que vincula la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y específicamente HIF-1α, de manera opuesta en distintos tejidos. Sin embargo, no está descrito como hipoxia regula la expresión de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético. El objetivo de esta tesis es estudiar el mecanismo molecular y las vías de señalización involucradas en la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y TGF-β en distintos tipos celulares que componen el músculo esquelético in vitro e in vivo. Para este análisis sometimos sistemáticamente fibroblastos, mioblastos y miotubos, de líneas celulares y cultivo primario, a condiciones de hipoxia en una cámara de cultivo con atmosfera controlada junto con estimulación con TGF-β. En primer lugar, encontramos que los tratamientos a distintos tiempos en atmosfera hipóxica no indujeron la expresión de CTGF/CCN2 en ninguno de los tipos celulares mencionados anteriormente. Interesantemente, encontramos que específicamente los miotubos sobreexpresan CTGF/CCN2 tras la activación conjunta de la ruta de señalización de hipoxia mediada por HIF-1α y TGF-β. Describimos que el efecto de ambas rutas sobre la expresión de CTGF/CCN2 es de tipo sinérgico, depende del factor de transcripción HIF-1α y requiere de las rutas de señalización no canónicas de TGF-β. Finalmente, probamos estos resultados in vivo utilizando 2 metodologías para activar la ruta señalización de hipoxia mediada por HIF-1α: mediante estabilizadores farmacológicos de HIF-1α y a través de isquemia por escisión de la arteria femoral. Combinamos estas metodologías con inyecciones intramusculares de TGF-β y logramos recapitular el efecto observado in vitro. Tras la activación farmacológica de HIF-1α y la inyección intramuscular de TGF-β observamos un efecto sinérgico en la expresión de CTGF/CCN2 y dicha expresión se encontró localizada en las fibras musculares in vivo. En base a esto postulamos que las fibras musculares son la principal fuente de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético en respuesta a hipoxia y TGF-β; y contribuyen a la progresión de la patología fibrótica.La fibrosis es una condición recurrente en varias patologías asociadas al músculo esquelético entre ellas: la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), diferentes patologías neuromusculares como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) o aquellas asociadas a denervación, y en daño crónico. La fibrosis muscular se caracteriza por la acumulación excesiva de proteínas de matriz extracelular (ECM), inflamación persistente, daño muscular y sobreexpresión de factores profibróticos. Entre estos últimos se encuentran; el factor de crecimiento transformante tipo β (TGF-β) y el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF/CCN2). Varios antecedentes muestran que músculos fibróticos también están asociados a un daño vascular. Resultados preliminares de nuestro laboratorio en modelos murinos que desarrollan fibrosis muestran una disminución en la cantidad de capilares que rodean las fibras musculares. En consecuencia, esto se asocia a una disminución en la perfusión sanguínea y por lo tanto a una disminución en la tensión de oxígeno en el tejido. Este fenómeno se define como hipoxia y lleva a la activación de mecanismos moleculares de respuesta que promueven la supervivencia celular y adaptación a bajas concentraciones de oxígeno. Sin embargo, la relación entre hipoxia y fibrosis no ha sido estudiada en el músculo esquelético. El factor transcripción inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) es el regulador central de la respuesta molecular a hipoxia, mientras que CTGF/CCN2 es una proteína matricelular clave en la inducción de la fibrosis. Existe evidencia previa que vincula la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y específicamente HIF-1α, de manera opuesta en distintos tejidos. Sin embargo, no está descrito como hipoxia regula la expresión de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético. El objetivo de esta tesis es estudiar el mecanismo molecular y las vías de señalización involucradas en la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y TGF-β en distintos tipos celulares que componen el músculo esquelético in vitro e in vivo. Para este análisis sometimos sistemáticamente fibroblastos, mioblastos y miotubos, de líneas celulares y cultivo primario, a condiciones de hipoxia en una cámara de cultivo con atmosfera controlada junto con estimulación con TGF-β. En primer lugar, encontramos que los tratamientos a distintos tiempos en atmosfera hipóxica no indujeron la expresión de CTGF/CCN2 en ninguno de los tipos celulares mencionados anteriormente. Interesantemente, encontramos que específicamente los miotubos sobreexpresan CTGF/CCN2 tras la activación conjunta de la ruta de señalización de hipoxia mediada por HIF-1α y TGF-β. Describimos que el efecto de ambas rutas sobre la expresión de CTGF/CCN2 es de tipo sinérgico, depende del factor de transcripción HIF-1α y requiere de las rutas de señalización no canónicas de TGF-β. Finalmente, probamos estos resultados in vivo utilizando 2 metodologías para activar la ruta señalización de hipoxia mediada por HIF-1α: mediante estabilizadores farmacológicos de HIF-1α y a través de isquemia por escisión de la arteria femoral. Combinamos estas metodologías con inyecciones intramusculares de TGF-β y logramos recapitular el efecto observado in vitro. Tras la activación farmacológica de HIF-1α y la inyección intramuscular de TGF-β observamos un efecto sinérgico en la expresión de CTGF/CCN2 y dicha expresión se encontró localizada en las fibras musculares in vivo. En base a esto postulamos que las fibras musculares son la principal fuente de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético en respuesta a hipoxia y TGF-β; y contribuyen a la progresión de la patología fibrótica.
Estudio del rol biológico de la fructosa en células de cáncer prostático
(2022) Corro Acuña, Néstor Bastián; Godoy, Alejandro S.; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El cáncer prostático (CaP) es uno de los cánceres de mayor prevalencia en hombres tanto en países occidentales desarrollados como en vías de desarrollo. Un número relevante de estudios epidemiológicos han vinculado la progresión del CaP de alto grado con el consumo de dietas altas en grasas, carbohidratos y obesidad. Para poder sostener la alta demanda por glucosa necesaria para alimentar sus altas tasas de proliferación, las células de cáncer sobreexpresan el transportador de glucosa 1 (GLUT-1). Dicha sobreexpresión ha sido utilizada como fundamento en técnicas de imagen como la tomografía por emisión de positrones (PET), utilizando moléculas como la fluorodesoxiglucosa (FDG) para detectar tumores primarios y metastásicos. Pero el PET-FDG ha mostrado una aplicabilidad clínica limitada al estadificar el CaP. Además, nuestro laboratorio ha reportado la sobreexpresión de transportadores GLUT-2, y 5 (ambos descritos como transportadores de fructosa), en células de CaP en desmedro de GLUT-1. La fructosa es una hexosa presente en alimentos procesados y su excesivo consumo ha sido vinculada a patologías como hígado graso no alcohólico, gota y síndrome metabólico, así como cáncer de mama, páncreas e intestinal, esbozando la posibilidad que fructosa podría dar el soporte proliferativo a las células de CaP en lugar de glucosa. Por lo tanto, la hipótesis de este trabajo doctoral es que “las células de cáncer prostático captan fructosa intrínsecamente y que dicho transporte incrementa características celulares asociadas tanto a capacidades proliferación como de agresividad tumoral con respecto a glucosa”. Para poder confirmar esta hipótesis, primero se evaluó in vitro la capacidad de fructosa en incidir en parámetros como la tasa de proliferación, la viabilidad celular y la capacidad migratoria/invasiva con respecto a glucosa en modelos celulares benignos y malignos de CaP. También estudiamos valores cinéticos del transporte de fructosa en líneas celulares malignas de CaP. Posteriormente evaluamos el crecimiento tumoral en modelos in vivo de xenotransplante de CaP expuestos a la incorporación de fructosa o glucosa en la dieta, así como describir la expresión de transportadores GLUTs de fructosa y glucosa en los tumores. Finalmente analizamos el efecto de la incubación con fructosa o glucosa por hasta 72 horas sobre los niveles de ATP intracelular (ATPi), lactato intracelular, y su impacto en los niveles relativos de algunas enzimas metabólicas de interés mediante qPCR. Los resultados demostraron que fructosa podía mantener tasas de proliferación y viabilidad comparables a glucosa y aunque no modifica capacidades migratorias, si incrementa la invasividad tumoral en modelos in vitro de CaP. Los estudios cinéticos describieron que las células de CaP poseen una afinidad de transporte por fructosa correspondiente a la descrita para GLUT-5, sugiriendo que es GLUT-5 quien media este transporte. Ensayos de knockdown de GLUT-5 mediante siRNA confirmaron esta observación. La adición de fructosa en el agua de beber incrementó el tamaño de los tumores de modelos murinos de xenotransplante derivados tanto de línea celulares de PC3 como muestras clínicas, mientras glucosa en el agua no incidió significativamente sobre el tamaño tumoral con respecto al control. El análisis inmunohistoquímico de los tumores postratamiento reportó aumentos en los niveles de expresión de GLUT-5, 9 en presencia de fructosa con respecto a glucosa y control. Los niveles de ATPi se vieron incrementados tanto con glucosa como con fructosa al cabo de 72 horas en células malignas de CaP, pero no en benignas. Los niveles de ATPi con fructosa fueron significativamente menores con respecto a glucosa. Por otra parte, los niveles de lactato intracelular en células cultivadas con fructosa en el medio presentaron una disminución significativa respecto al control, mientras glucosa incremento dicho valor, sugiriendo que los metabolitos están siendo desviados a otras vías metabólicas o que el transporte de lactato ha sido afectado por la incubación con fructosa. Finalmente, se analizaron los niveles relativos de mRNA de las enzimas metabólicas, encontrando la sobreexpresión de las enzimas HK-2, G6PDH y FASN en células LNCaP y DU145. La importancia de este estudio radica en demostrar que fructosa es una hexosa que puede alimentar a las células de CaP mediante GLUT-5, un transportador que se sobre expresa en células y tejidos malignos de CaP y que tiene potencial para sostener la proliferación y viabilidad celular maligna. Aunque el mecanismo por el cual esta potenciación no está aún descrito, nuestros datos sugieren que dicho mecanismo involucra el consumo de fructosa dietética, influye en metabolitos como ATP y lactato intracelular, y puede modular la actividad de algunas enzimas a nivel de transcrito, lo que demuestra que fructosa y su metabolismo en CaP tienen potencial de ser utilizados como blancos terapéuticos o biomarcadores en CaP.
Galectin-9 promotes an immune-suppresive microenvironment in gastric cancer
(2021) Hill Machado, Charlotte Nicole; Owen, Gareth Ivor; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Las inmunoterapias con anticuerpos bloqueadores de proteínas inmuno-reguladoras o ‘immune checkpoints’ han revolucionado el tratamiento del cáncer gástrico (GC), particularmente los anticuerpos contra el receptor PD-1. Sin embargo, la presencia de un microambiente inmunosupresor y la redundancia entre proteínas inmuno-reguladoras podría ser responsable por el alto porcentaje de pacientes que no presenta un beneficio clínico. Una proteína imuno-reguladora emergente es el receptor Tim-3, una proteína de membrana capaz de promover inmunosupresión. A pesar de que este receptor ha adquirido recientemente relevancia en el campo de la inmuno-oncología, la expresión y rol de su ligando Galectina-9 (Gal-9) en GC aún no han sido determinados. Se evaluó el patrón de expresión de Tim-3 y Gal-9 en el transcriptoma adenocarcinomas gástricos de la base de datos TCGA mediante análisis bioinformáticos (TIMER©, Cibersort y Xcell). Para evaluar el rol de Gal-9 en células de cáncer se transfectaron líneas celulares AGS y GES-1 y se evaluó el efecto de Gal-9 sobre su viabilidad, migración, invasión y expresión de proteínas inmuno-reguladoras. También se utilizó Gal-9 recombinante (rhGal-9) para tratar células endoteliales de cordón umbilical humanas (HUVEC) y evaluar su efecto sobre la capacidad angiogénica de estas células. Finalmente se evaluó el efecto de rhGal-9 sobre cultivos primarios de linfocitos T en presencia o ausencia de anticuerpos bloqueantes de los receptores inmuno-reguladoras PD-1 y Tim-3. Se evaluó la frecuencia de las poblaciones de células CD8+ disfuncionales y de células T reguladoras (Treg). Los análisis de la base de datos TCGA demostraron que los niveles de mRNA de Gal-9 y Tim-3 están aumentados en STAD en relación a tejido gástrico sano. Los niveles de Tim-3 también presentaron un incremento significativo en STAD invasivos. También se observó que Gal-9 y Tim-3 presentan una correlación con otras proteínas inmuno-reguladoras como PDL-1 (el ligando de PD-1), resultado que fue posteriormente confirmado por nuestros experimentos in vitro donde la transfección de Gal-9 aumentó la expresión de su receptor Tim-3 y de PDL-1 en células de GC. Consistente con el aumento de los niveles de Tim-3 en tumores avanzados, Gal-9 incrementó la migración e invasión de las células AGS y GES-1, así como también la migración y angiogénesis in vitro en HUVEC. También a través de análisis bioinformáticos observamos una fuerte correlación positiva entre los niveles de Gal-9 y la firma molecular de células CD8+ disfuncionales y Treg infiltrantes de tumores, sugiriendo que Gal-9 podría tener un rol en el aumento de la disfunción de células CD8+ y en la expansión de Treg en el tumor. A través de experimentos in vitro, observamos que tanto rhGal9 como células de cáncer transfectadas con Gal-9 aumentan la frecuencia de las poblaciones disfuncionales PD1+ Tim-3+ y PD1+ Tim-3+ LAG3+ , así como de la frecuencia de Treg de manera Tim-3 dependiente. Estos resultados sugieren una asociación entre la vía de Gal-9/Tim-3 y tumores más agresivos con un microambiente más inmunosupresor. Dado que la disfunción de células T ha sido asociada a la resistencia a inmunoterapia, evaluamos si es que Gal-9 pudiera ejercer efectos similares en presencia de un anticuerpo αPD1. Como era esperado, el αPD1 disminuyó las poblaciones disfuncionales, sin embargo no en presencia de rhGal-9. Esto indica que Gal-9 puede promover el fenotipo disfuncional a pesar del bloqueo de PD1, lo cual apoya el uso de estrategias combinatorias utilizando bloqueadores de PD1 y Tim-3 en la clínica. Debido a que Gal-9 es una proteína secretada y detectable en plasma, proponemos que sus niveles plasmáticos podrían servir como un biomarcador para la inmunoterapia combinada (αPD1 + αTim3). Más aún, un aumento en los niveles circulantes de Gal-9 en pacientes recibiendo la monoterapia con αPD1 podría indicar mayor probabilidad de resistencia adquirida y momento para iniciar la terapia combinada
Hemicanales formados por Cx43, Panx1 y el receptor P2X, son críticos en la respuesta neuroinflamatoria inducida por la exposición maternal a glucocorticoides y la epilepsia
(2016) Maturana Fourniel, Carola; Sáez, Juan Carlos; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La inflamación se asocia frecuentemente a una respuesta del sistema inmune, dirigida a eliminar agentes infecciosos y señales moleculares de peligro o productos del daño tisular. Sin embargo, la inflamación puede ser causa o consecuencia de un gran número de enfermedades crónicas y es estrictamente controlada por varios complejos multimoleculares citosólicos denominados inflamasoma presentes no sólo en las células del sistema inmune, sino que además han sido detectadas en diversas células parenquimales. Tras la activación del inflamasoma, las células liberan mediadores inflamatorios (Ej.: IL-1β), que desempeñan un papel crucial en el desarrollo de la neuroinflamación en trastornos neurodegenerativos y trastornos psiquiátricos, como la epilepsia y la depresión, respectivamente. El aumento de Ca+2 citoplasmático promueve el ensamblaje de los componentes del inflamasoma y su activación; por lo cual se ha sugerido la participación de los hemicanales (HCs) formados por las conexinas (Cxs) y pannexina 1 (Panx1), así como el receptor de P2X7 (P2X7R), en la activación del inflamasoma inducida por ATP. Cabe hacer notar que la epilepsia puede ser consecuencia de una alteración traumática o estrés perinatal y se desconoce si la neuroinflamación desencadenada en dicho período de vida se refleja en la activación de los HCs gliales. Por otro lado, evidencias clínicas y experimentales sugieren una posible conexión entre la epilepsia y la neuroinflamación, que se caracteriza por la acumulación, activación y proliferación de microglias y astrocitos. Sin embargo, los fármacos de uso actual para tratar la epilepsia están dirigidos a blancos moleculares localizados en neuronas y no en las células gliales.En el estrés agudo y en especial el estrés crónico o los altos niveles de glucocorticoides (GCs) inducen la respuesta neuroinflamatoria, que se refleja en un aumento de la expresión de las proteínas del inflamasoma y la reactividad de microglias y astrocitos. No obstante, la participación de los oligodendrocitos en estos procesos ha sido poco estudiada. Más aún, se desconoce si en oligodendrocitos se expresa y activa un inflamasoma en procesos neurodegenerativos. En base a estos antecedentes, aquí se postula que, “los oligodendrocitos expresan el inflamasoma NLRP3 que se activa con la exposición prenatal a glucocorticoides, y que a su vez, como en la epilepsia inducida por PTZ, promueven la activación de hemicanales y el receptor purinérgico P2X7R en células cerebrales”. Con el fin de generar información que aclare las incógnitas descritas arriba, en la presente tesis se utilizaron crías (2 días de edad) de madres controles y madres tratadas con dexametasona (DEX, GC sintético) desde el día 12 de gestación. Rebanadas de cerebro de crías controles revelaron la presencia de las proteínas que conforman el complejo multimolecular: la proteína de señalización, NLRP3; la proteína adaptadora, ASC y la proteína de activación, caspasa-1 (Casp-1, forma activa); cuyos niveles incrementaron significativamente en rebanadas de cerebro de crías de madres expuestas a DEX.La actividad de los HCs (ensayos de captación de etidio en cortes de hipocampo) aumentó en microglias, astrocitos y oligodendrocitos de crías de madres expuestas a DEX y fue inhibida por bloqueadores de HCs Panx1 y Cx43 (péptidos 10panx1 y Gap26, respectivamente) y del P2X7R (A740003). Además, se utilizó D4, un bloqueador selectivo de HCs Cxs identificados por “screening” virtual de la base de datos del NCI y utilizando la estructura cristalina de la Cx26 y boldina como farmacóforo. D4 inhibió completamente la actividad de los HCs en células gliales. La actividad de los HCs inducida por exposición prenatal a DEX persistió durante al menos 8 semanas después del nacimiento y no fue revertida por los cuidados de una nodriza no expuesta a DEX durante el primer mes o la posterior crianza junto a los hermanos del mismo sexo durante el segundo mes de vida. Por lo tanto, el inflamasoma en las células gliales se activaría por la por la exposición a DEX y se mantendría durante un largo tiempo postnatal. Se sugiere que estos cambios podrían alterar la neurogénesis y conectómica perinatal.Para estudiar el posible papel de los HCs en la epilepsia, se utilizaron ratones machos adultos que fueron tratados con pentilentetrazol (PTZ), un agente epileptógeno que actúa como antagonista no selectivo de los receptores GABAA. Las convulsiones fueron evidentes en ~7 min después de la administración de PTZ seguido por un período de varias horas, en la cual los ratones presentaron actividad motora muy baja y espasmos musculares esporádicos con ~70% de supervivencia. Sin embargo, en los animales pretratados con D4 se previno las convulsiones en su mayoría. Cuando no se previnieron las convulsiones, el período de estatus epiléptico se acotó a ~7 min después de la administración de PTZ. Transcurrida la convulsión, los animales se comportaron como los controles con 100% de supervivencia. Además, D4 inhibió completamente la actividad de los HCs gliales inducida por PTZ. Por otro lado, el pretratamiento con el bloqueador P2X7R también inhibió la actividad de los HCs inducida por PTZ. En consecuencia, la activación de los HCs inducida por PTZ en neuronas y células gliales involucra la participación de HCs Cxs y P2X7R. Además, se observó que crías de madres tratadas con DEX durante el período de gestación y luego tratadas con una dosis subepileptógena de PTZ manifiestan convulsiones características de un episodio de epilepsia, sugiriendo que la inflamación desencadenada en la gestación favorece la manifestación de epilepsia en estado adulto. Estos resultados en conjunto apuntan a los HCs gliales como potenciales blancos terapéuticos en estados patológicos cerebrales que conllevan a procesos inflamatorios.
Interacción molecular de los receptores CRH-R2 y DA-D1 en el área tegmental ventral de rata.
(2013) Araya Gutiérrez, Katherine Angélica; Gysling Caselli, Katia; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La administración repetida de drogas de abuso genera cambios plásticos perdurables que se traducen en alteraciones en las propiedades funcionales de las neuronas del sistema mesocorticolímbico, como lo es la sensibilización de la liberación de glutamato en el área tegmental ventral (VTA) inducida por la administración repetida de cocaína, esto determina la recaída a la droga (Wang y cols. 2005). Dicha sensibilización estaría siendo modulada por la activación de receptores dopaminérgicos D1 (DA-D1) y de los receptores CRH-R2. Por otra parte, se ha observado que la administración repetida de cocaína también induce una facilitación de la transmisión glutamatérgica presináptica, en la corteza prefrontal (CPF), dicha facilitación glutamatérgica estaría mediada por la co-activación de receptores CRH-R2 y DA-D1, sugiriendo que dichos cambios estarían ocurriendo por uno o más mecanismos como: cooperatividad entre los receptores, vías de señalización en común y/o por la formación de heterómeros de los receptores DA-D1 y CRH-R2. La interacción funcional y/o molecular de receptores metabotrópicos o heterómeros de receptores, ha aportado interesantes hallazgos sobre la regulación de la liberación de glutamato en núcleos del cerebro como el Cuerpo Estriado. En base a estos antecedentes no propusimos estudiar el papel de los receptores DAD1 y CRH-R2 en la sensibilización de la liberación de glutamato en el VTA inducida por la administración repetida de cocaína. Nuestros resultados muestran que existe una interacción funcional entre dichos receptores sólo en las ratas expuestas al tratamiento repetido con cocaína. Con respecto a la localización, hemos determinado que existe un 34,1 % de la población de terminales glutamatérgicos de origen subcortical que poseen receptores DA-D1 y CRH-R2. Finalmente, hemos demostrado por varias técnicas que existe una interacción molecular entre los receptores CRH-R2 y DA-D1.
Lipopolisacárido afecta el transporte mucociliar alterando el mecanismo de liberación de ATP que regula la actividad ciliar en las vías respiratorias de ratón
(2014) Carreño Bustos, Daniela Verónica; Villalón, Manuel J.; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
En el epitelio mucociliado, la eficiencia del transporte mucociliar (TMC) es determinada por la frecuencia de batido ciliar (FBC) y la actividad coordinada del movimiento de los cilios. Señales químicas producidas localmente por el epitelio como el adenosin trifosfato (ATP), pueden modificar la actividad ciliar del epitelio respiratorio, por su interacción con los receptores purinergicos P2Y. Lipopolisacarido (LPS) un componente de la pared bacteriana, un conocido agente inflamatorio, cuyos efectos están mediados por el receptor TLR4, sin embargo hay poca evidencia sobre los efectos de LPS sobre la actividad ciliar y los mecanismos de liberación de ATP en epitelio respiratorio. Para estudiar el efecto de LPS en la actividad ciliar y las vías de señalización involucradas, utilizamos cultivos primarios de epitelio ciliado de tráquea de ratón. La FBC fue determinada mediante videomicroscopia y el ATP extracelular fue medido mediante el ensayo de luceferin luciferasa, en condiciones control y en presencia de fármacos antagonistas e inhibidores de las distintas vías de señalización. También determinamos la velocidad de transporte mucociliar por el movimiento de las microesferas sobre el epitelio de la tráquea.En este estudio, determinamos que LPS incrementa la FBC y la velocidad de transporte de las microesferas. El incremento en la FBC está asociado a un incremento en ATP extracelular. El incremento de la FBC fue bloqueado mediante el uso de apirasa, enzima que hidroliza el ATP extracelular. La participación de la vía de señalización TLR fue evaluado en el efecto de LPS sobre la FBC. Mediante PCR e inmunofluorescencia detectamos la expresion del receptor TLR4 en los cultivos primarios. Antagonistas de NF-κB no lograron bloquear el incremento de la FBC inducido por LPS, sugiriendo que la activación de este factor de transcripción no participa en el incremento de la FBC.Usando antagonistas de receptores purinergicos P2X7 (P2X7R) y Panexina 1 (Panx1), determinamos que ambos participan en el mecanismo de liberación de ATP inducido por LPS. Adicionalmente, establecimos mediante el ensayo de captación de colorante, que LPS induce apertura de Panx1. Un quelante de Ca2+, BAPTA-AM bloquea el incremento en la FBC y la liberación de ATP inducido por LPS. Antagonistas específicos de la vía de señalización P2Y, bloquean el incremento en la FBC inducido por LPS. Estos resultados sugieren que LPS induce liberación de ATP al extracelular por un mecanismo que involucra la participación de Panx1 y P2X7R y luego este ATP activa la vía de señalización mediada por la vía de señalización P2Y. En conclusión, nuestros resultados demuestran que LPS es una señal química que participa en la regulación de la actividad del batido ciliar, aumentando la FBC y la velocidad del transporte mucociliar en células ciliadas de tráquea de ratón. Estos resultados dan evidencias del mecanismo por el cual factores ambientales pueden inducir una respuesta fisiológica funcional que afecta el clearance mucociliar.
Mecanismos que controlan la entrada de calcio extracelular que se asocian a la respuesta de hiperpermeabilidad venular
(2020) Burboa Schettino, Pía Carolina; Figueroa, Xavier; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Las células endoteliales constituyen una barrera de permeabilidad entre la sangre y el intersticio. Normalmente en las células endoteliales de los capilares ocurre el intercambio de gases y pequeñas moléculas, sin embargo, en la inflamación ocurre una hiperpermeabilidad a macromoléculas principalmente a nivel de células endoteliales de vénulas postcapilares. Agentes inflamatorios como Histamina o PAF producen la hiperpermeabilidad mediante el incremento en la concentración de calcio intracelular [Ca2+]i. El aumento de calcio (Ca2+) se produce por su liberación desde los reservorios intracelulares del retículo a través del aumento de IP3, pero esto no explica la mantención de la señal en el tiempo lo que sugiere que la entrada de Ca2+ desde el medio extracelular también participa activamente en este proceso. Dentro de los mecanismos propuestos están los hemicanales formados por conexina y canales de panexina, que podrían participar en la entrada directa de Ca2+ o de manera indirecta a través de la liberación de ATP y activación de receptores purinérgicos. Otro componente importante es la producción de óxido nítrico (NO), por la activación de la isoforma endotelial de la enzima óxido nítrico sintasa (eNOS). En ese contexto, se ha estudiado que el incremento de la hiperpermeabilidad por NO, ocurre a partir de la activación de la eNOS, y su subsecuente traslocación al citosol que conduce a la S-nitrosilación de proteínas componentes de las uniones adherentes. Por otro lado, también un mecanismo dependiente de voltaje podría participar en el aumento de Ca2+ asociado a la hiperpermeabilidad. Estudios en la red vascular de mejilla de hámster demostraron la participación de canales de calcio dependientes de voltaje (Cav) en el aumento de la hiperpermeabilidad. Si bien el trabajo no explica la apertura de estos canales Cav, podría ser a través de la participación de canales de sodio dependientes de voltaje (Nav), sin embargo, sólo se han descrito estos canales en vena safena mediante estudios electrofisiológicos, por lo tanto, se desconoce la participación de los canales Nav en hiperpermeabilidad. Hasta la fecha aún no se han integrado todos los componentes mencionados en un mecanismo que explique la hiperpermeabilidad en vénulas postcapilares, es así que la hipótesis de esta tesis propone que “el aumento de Ca2+ inducido por PAF es mediado por la activación de canales de Nav y una posterior activación de la eNOS. Esto incrementa la producción de NO, que a través de la snitrosilación de hemicanales formados por conexina y/o canales formados por panexina induce su apertura, permitiendo la entrada directa de Ca2+ o de manera indirecta a través de la liberación de ATP, lo cual permite la mantención de la respuesta a lo largo del tiempo.” Los objetivos generales son: 1) Evaluar si los hemicanales formados por conexinas y los canales de panexinas participan en el aumento de Ca2+ asociado a la hiperpermeabilidad inducida por PAF; 2) Evaluar si la producción de NO contribuye al aumento de Ca2+ inducido por PAF a través de la apertura de hemicanales de conexinas y canales de panexinas; 3) Evaluar si los canales de Na+ dependientes de voltaje (Nav) están involucrados en el aumento de Ca2+ inducido por PAF; 4) Evaluar la participación de hemicanales de conexina, canales de panexina y canales Nav en la respuesta de hiperpermeabilidad inducida por PAF. La estrategia experimental involucró la realización de cultivo selectivo de células endoteliales provenientes de vénulas postcapilares en mesenterio de rata donde se realizó medición de calcio intracelular, captación de colorante etidio en presencia y ausencia de inhibidores de conexinas, panexina 1, eNOS y canales Nav. También se midió la liberación de ATP, variación de potencial por electrofisiología en presencia y ausencia de inhibidores de canales Nav y la formación de poros en monocapa de este cultivo con Microscopía de Fuerza Atómica. También se realizó preparación de la red vascular intacta de mesenterio de rata y se realizó medición de captación de colorante etidio en presencia y ausencia de inhibidores de conexinas y panexina 1. Los resultados mostraron que PAF induce un incremento en la captación de etidio en vénulas intactas y en cultivos de células endoteliales de vénulas postcapilares, lo cual se asocia a un rápido incremento de la [Ca2+]i y a la formación de poros. Tanto la captación de etidio como el aumento de la [Ca 2+ ]i estimulado por PAF, se bloqueó al tratar con los péptidos inhibidores de conexinas 37,43Gap27 o 43Gap26 y el péptido inhibidor de panexina 1, 10Panx, sin embargo, el tratamiento con PPADS sólo atenuó parte del incremento de la [Ca2+]i y no afectó la captación de etidio, sugiriendo que es un evento posterior a la apertura de hemicanales formados por conexina o canales formados por panexina. PAF también produjo un incremento en la liberación de ATP, que fue inhibido al tratar con 43Gap26 o 10Panx y produjo la S-nitrosilación mediada por NO de conexina 43. Consistente con esto, el bloqueo de la producción de NO con LNA produjo una inhibición en la captación de etidio y en el aumento de la [Ca2+]i. Además, se observó que PAF produce la generación de espigas despolarizantes en el potencial de membrana de células endoteliales de vénulas postcapilares y que el tratamiento con TTX bloquea las señales despolarizantes y el aumento de la [Ca2+] i . Consistente con lo anterior, el tratamiento con Lamotrigina, un inhibidor de los canales Nav1.2, prácticamente abolió la respuesta de Ca2+ inducida por PAF. Finalmente, el tratamiento con 37,43Gap27 o TTX, bloqueó la formación de poros inducida por PAF. Los resultados de esta tesis sugieren que la estimulación de las células endoteliales de vénulas postcapilares con PAF aumenta la [Ca2+]i a través de la apertura de canales Nav1.2, activación de la enzima eNOS y producción de NO que lleva a la S-nitrosilación de la Cx43 y la apertura de hemicanales formados por esta conexina, y por otro mecanismo, la apertura de canales formados por Panx1, donde ambos componentes, permitirían la entrada directa de Ca2+ y de manera indirecta mediante la liberación de ATP con la subsecuente activación de receptores purinérgicos, este mecanismo permitiría la mantención de la respuesta de hiperpermeabilidad en el tiempo.
Mechanisms of long-distance control of dendritic growth by Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) in central neurons.
(2019) Moya Alvarado, Guillermo Adrián; Bronfman C., Francisca; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) se expresa ampliamente en muchos circuitos del sistema nervioso central (SNC) y se une a sus receptores TrkB y p75 para desencadenar diferentes vías de señalización, tales como las quinasas ERK1/2, PI3K-mTOR y la vía de la PLCg-Ca+2. De esta manera favorece el crecimiento dendrítico y la plasticidad sináptica. Una vez que BDNF une a sus receptores de membrana TrkB y p75, estos se endocitan formando endosomas de señalización. En el sistema nervioso periférico (SNP) está descrito que las neurotrofinas unen a sus receptores en el axón y transmiten señales al cuerpo celular mediante el transporte axonal de endosomas de señalización favoreciendo la sobrevida neuronal. Sin embargo, el rol funcional de los endosomas de señalización BDNF/TrkB en las neuronas centrales, se desconoce. El propósito general de esta tesis fue estudiar el papel de la ruta endosomal en la señalización a larga distancia de BDNF/TrkB en las neuronas corticales y su regulación por las vías clásicas de regulación como PI3K y PLCg. El primer objetivo de nuestro trabajo fue estudiar si BDNF aumenta la actividad de la GTPasa Rab5 de manera temporal y espacial y si esto se traduce en una modificación de la dinámica de estos endosomas en dendritas y cuerpos celulares. Las proteínas Rabs son GTPasas monoméricas que actúan como interruptores moleculares para regular el tráfico de membranas al unirse a una amplia gama de efectores. Entre las Rab GTPasas, Rab5 es la GTPasa clave que regula los endosomas tempranos y es el primer organelo en la ruta endocítica de receptores de membrana. Para estudiar el rol de Rab5 sobre la señalización neuronal de BDNF, nosotros hicimos experimentos de microscopía de fluorescencia en células fijadas y células vivas, además evaluamos, mediante el uso de adenovirus que sobreexpresan un dominante negativo de Rab5, si la actividad de la GTPasa era requerida para la arborización inducida por BDNF. Nuestros estudios mostraron que tiempos breves de tratamiento con BDNF aumentó la colocalización de TrkB con Rab5 en dendritas, aumentando el número y la movilidad de los endosomas positivos para Rab5. Estos hallazgos se complementan con estudios que mostraron que la actividad de Rab5 es requerida para la ramificación dendrítica inducida por BDNF. Estos datos muestran que BDNF regula la dinámica de los endosomas tempranos mediante el aumento de la actividad y número de endosomas Rab5 y sugieren que estos procesos son requeridos para la ramificación dendrítica inducida por BDNF. Posteriormente, nos preguntamos por el rol funcional de la señalización axonal de BDNF en las neuronas corticales y el posible papel de los endosomas de señalización. Para esto utilizamos cultivos de neuronas corticales sembradas en cámaras de microfluidos, modelo que nos permitió aislar el componente axonal del somatodendrítico y así estudiar mediante microscopía de fluorescencia el efecto de la estimulación axonal de BDNF sobre la ruta de señalización de TrkB en los cuerpos celulares y axones. Nosotros encontramos que la incubación con BDNF en axones aumenta la ramificación dendrítica en los cuerpos celulares. Usando distintos modelos de animales transgénicos, encontramos que este proceso es mayormente mediado por los receptores TrkB y no p75. Además, encontramos que la arborización dependía de la activación del factor de transcripción CREB en el núcleo y la vía PI3K-mTOR en los cuerpos celulares aumentando la síntesis de proteínas somatodendríticas. Por otra parte, la actividad de PI3K en axones no fue necesaria para el transporte de BDNF, ni para el efecto en la arborización en el cuerpo celular. Mediante el uso de neuronas corticales derivadas de ratones knock-in TrkBF616A y el uso de cultivos compartimentalizados, pudimos mostrar que se requiere de la actividad del receptor TrkB activo en el cuerpo celular inducido por BDNF en el axón, para los efectos dendríticos observados en el cuerpo celular. Por otro lado, las actividades de Rab5 y dineína fueron requeridas para estos efectos. Todos estos resultados en su conjunto sugieren la generación y transporte de endosomas de señalización para la señalización a larga distancia de BDNF. A continuación, debido a la poca información disponible sobre cómo las rutas rio abajo de TrkB regulan la señalización de larga distancia, estudiamos el papel de la señalización de la PLCg en la señalización axonal mediada por BDNF. Utilizando cultivos compartimentalizados, demostramos que la actividad axonal de PLCg es necesaria para la arborización dendrítica y la fosforilación de CREB. Estos resultados se correlacionaron con el aumento de los niveles axonales de Ca+2 inducido por BDNF en los axones de una manera dependiente del PLCg. Adicionalmente, encontramos que la ruta PLCg/Ca+2 es necesaria para la endocitosis de TrkB en el axón. En resumen, estos resultados sugieren que la señalización axonal a larga distancia de BDNF posee un rol funcional en neuronas corticales, regulando la activación de proteínas claves para la traducción de proteínas y la arborización dendrítica.
Modulación del procesamiento de la proteína precursora del amiloide por la tirosina quinasa C-ABL y su implicancia en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C /
(2016) Yáñez Henríquez, María José; Álvarez Rojas, Alejandra; Zanlungo Matsuhiro, Silvana; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La enfermedad de Niemann-Pick tipo C (NPC) es un desorden hereditario autosómico recesivo causado por mutaciones en dos genes que codifican para las proteínas NPC1 y NPC2. Estas proteínas participan en el tráfico intracelular de lípidos y su deficiencia causa la acumulación de colesterol en los lisosomas. Sorpresivamente en distintas regiones del SNC de pacientes NPC, se han detectado aumentos del péptido β-amiloide (Aβ), el elemento patogénico causante de la pérdida sináptica y la muerte neuronal en la Enfermedad de Alzheimer (EA). Estudios in vitro e in vivo indican de que la pérdida de NPC1 conduce a un aumento significativo en los niveles de βCTF y sAPPβ. Resultados de nuestro laboratorio indican que la quinasa c-Abl se encuentra activada en la enfermedad de NPC. Además, c-Abl interactúa y fosforila la proteína precursora amiloide (APP), sin embargo, la relevancia de esta interacción no se ha definido aun. En este trabajo, se observó que la inhibición de c-Abl, mediante el uso de Imatinib un inhibidor específico de c-Abl o expresando un ARN interferente (shRNA) específico para c-Abl, reduce los niveles de Aβ y βCTF y aumenta los niveles de sAPPα en células deficientes de NPC1 que sobreexpresan APP. Consistentemente el tratamiento con Imatinib resultó en una disminución en el procesamiento amiloidogénico de APP en ratones nulos para NPC1. Por otra parte, también encontramos disminución de los niveles de βCTF en cultivos de neuronas corticales derivadas de ratones c-Ablfloxo/floxo Nestin Cre (neuronas nulas para c-Abl).Además, encontramos que c-Abl interactúa con APP y que el motivo -YENP- en la cola citoplásmica de APP es esencial para su interacción con c-Abl. Mediante el uso de imágenes de fluorescencia de vida media (FLIM), se observó que Imatinib redujo significativamente la interacción de APP con c-Abl. Sin embargo, más relevante fue que se observó que la inhibición de c-Abl reduce la interacción de APP con BACE1, lo que es consistente con que c-Abl potencia la interacción APP-BACE1 y promueve el procesamiento amiloidogénico de APP y la secreción de Aβ en modelos de NPC. En este trabajo, nosotros reportamos que específicamente la mutación Y682A afecta a la formación del complejo de APP con BACE1. Estos resultados dan nuevos antecedentes para comprender el papel desempeñado por c-Abl en su interacción con APP y en la progresión de la degeneración neuronal. Además, muestran el papel crucial que desempeña el residuo Tyr682 en el control del procesamiento de APP en las células.
Neural mechanisms underlying the domain-general processes in cognitive control in healthy adults and multiple sclerosis patients
(2025) Figueroa Vargas, Alejandra Mabel; Aboitiz, Francisco; Cárcamo Rodríguez, Claudia Andrea; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Sociales; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Química y Farmacia; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Medicina
El control cognitivo es un proceso de dominio general que regula el comportamiento orientado a objetivos mediante la integración y coordinación de habilidades cognitivas como la memoria de trabajo, el control inhibitorio y la toma de decisiones. Este proceso depende de la actividad funcional de circuitos corticales y subcorticales, particularmente dentro de la red de demanda múltiple. Sin embargo, los mecanismos neurales y computacionales que subyacen al control cognitivo aún no se comprenden completamente, especialmente en contextos clínicos como la esclerosis múltiple. La esclerosis múltiple es una enfermedad neurodegenerativa, inflamatoria y desmielinizante del sistema nervioso central, caracterizada por déficits cognitivos tempranos que afectan principalmente la velocidad de procesamiento, el aprendizaje y la memoria. Se considera que estas alteraciones están relacionadas con cambios en la conectividad funcional y oscilatoria. Esta tesis investiga el control cognitivo en adultos sanos y en personas con esclerosis múltiple en etapas tempranas, utilizando un paradigma de conjunto de tareas que integra tres tareas cognitivas: memoria de trabajo (tarea visual tipo Sternberg), control inhibitorio (tarea Go-Nogo) y toma de decisiones (tarea de aprendizaje por reversión probabilística). Los análisis se realizaron en tres niveles: (1) Conductual, enfocándose en las variables relevantes de las tareas para comparar el desempeño entre los grupos; (2) Electrofisiológico, examinando la actividad oscilatoria en la banda de frecuencia theta y la conectividad funcional entre regiones frontales, parietales y temporales de la red de demanda múltiple; y (3) Computacional, analizando las correlaciones entre variables latentes subyacentes al comportamiento y variables neuronales asociadas con el control inhibitorio, la memoria de trabajo y la toma de decisiones. Este enfoque modeló la covariación entre los parámetros de modelos conductuales y neuronales para capturar patrones compartidos, proporcionando un marco integrador para comprender el procesamiento normal del control cognitivo. Además, se buscó identificar alteraciones tempranas en los mecanismos del control cognitivo observadas en personas con esclerosis múltiple. Los resultados evidencian que los procesos de control cognitivo comparten patrones comunes respaldados por la actividad oscilatoria en la banda theta dentro de las regiones de la red de demanda múltiple, particularmente en las cortezas frontal y parietal. En los participantes sanos, la actividad oscilatoria theta organiza procesos computacionales específicos de las tareas, permitiendo respuestas adaptativas a las demandas variables de estas. Por el contrario, las personas con esclerosis múltiple presentan alteraciones tempranas en la actividad oscilatoria, particularmente en la banda theta, incluso antes de que se manifiesten déficits conductuales y cognitivos. Estos hallazgos ofrecen nuevas perspectivas sobre los mecanismos neurales del control cognitivo, destacando la vulnerabilidad de la red de demanda múltiple en enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis múltiple. El estudio subraya la importancia de la actividad oscilatoria theta en la organización de los procesos cognitivos y proporciona un marco para comprender los déficits del control cognitivo en poblaciones clínicas.
Palmitic acid inhibits the autophagic flux in hypothalamic neurons.
(2020) Hernández Cáceres, María Paz; Morselli, Eugenia; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La obesidad es considerada una epidemia mundial, tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo. Uno de los factores más importantes que promueven el desarrollo de obesidad es el consumo de dietas altas en grasas (HFD) ricas en ácidos grasos saturados, como el ácido palmítico (PA). La ingesta crónica de una HFD se ha asociado con el incremento de enfermedades metabólicas, como la resistencia a la insulina. Se ha observado en ratones, que luego del consumo crónico de una HFD el PA se acumula en el hipotálamo, el área del cerebro encargada de mantener la homeostasis energética y de regular el metabolismo corporal. Uno de los mecanismos homeostáticos celulares clave que es afectado después del consumo de una HFD es la autofagia, el cual es un proceso catabólico mediado por los lisosomas, destinado a la degradación y reciclaje de componentes citoplasmáticos y orgánulos dañados. Durante el proceso de autofagia, el cargo celular es secuestrado dentro de una vesícula de doble membrana, llamada autofagosoma, la cual se fusiona con un lisosoma, formando un autolisosoma, donde, gracias a la actividad de las enzimas lisosómales, el cargo autofágico es degradado. Todo el proceso desde la síntesis del autofagosoma hasta su degradación lisosomal se denomina flujo autofágico. Es importante destacar que la desregulación del proceso de autofagia en neuronas del hipotálamo promueve el desarrollo de trastornos metabólicos, lo que sugiere que la autofagia hipotalámica tendría un papel clave en el control del metabolismo corporal. Además, niveles elevados de PA se han asociado con una disminución de la autofagia y con resistencia a la insulina en el hipotálamo. Sin embargo, actualmente se desconoce el mecanismo específico por el cual el PA disminuye la autofagia en las neuronas hipotalámicas. En este proyecto, proponemos que la inhibición de la autofagia inducida por el PA en neuronas hipotalámicas posee un papel fundamental en el desarrollo de trastornos metabólicos asociados a la obesidad, como la resistencia a la insulina. La hipótesis de esta tesis es que el ácido palmítico inhibe el flujo autofágico y disminuye la sensibilidad a la insulina en las células neuronales hipotalámicas. Los resultados arrojaron que, en la línea celular hipotalámica N43/5 y en cultivo primario de neuronas hipotalámicas de rata, el PA aumentó el número de estructuras autofágicas y los niveles de SQSTM1/p62, una proteína degradada durante el proceso de autofagia, sugiriendo que el PA inhibe el flujo autofágico en células neuronales hipotalámicas. Además, los niveles de expresión de distintos genes relacionados con la autofagia y que son esenciales para la formación del autofagosoma no variaron por la exposición al PA, lo que sugiere que el PA promueve la acumulación de estructuras autofágicas como consecuencia de la disminución del flujo autofágico en las células N43/5. Adicionalmente, mediante microscopía electrónica, observamos que el PA indujo la acumulación de grandes compartimentos celulares degradativos en las células neuronales hipotalámicas N43/5. Sin embargo, el PA no disminuyó la acidez lisosomal ni su actividad enzimática en la línea de células hipotalámicas. No obstante, la exposición de PA si afectó la dinámica de vesículas endolisosomales, disminuyendo la velocidad y la distancia recorrida por éstas, en las células N43/5. Luego, evaluamos por inmunofluorescencia la fusión de los autofagosomas con los lisosomas utilizando células N43/5 transfectadas con el constructo mcherry-GFP-LC3, y también mediante el análisis de colocalización entre marcadores de autofagosomas y lisosomas. Observamos que el PA es capaz de disminuir la fusión entre ambos organelos, así como de incrementar la acumulación de estructuras autofágicas de gran tamaño. Además, mediante un ensayo de pull-down cuantificamos el estado de activación de Rab7, una proteína involucrada tanto en la fusión del autofagosoma con el lisosoma como también en el tráfico endolisosomal, y observamos que en células N43/5 expuestas a PA los niveles Rab7 unida a GTP incrementaron, sugiriendo que el PA podría perjudicar la formación de autolisosomas a través de regulación de la actividad de Rab7. Además, mediante la técnica de etiquetado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular (SILAC), encontramos en lisosomas aislados de células N43/5 tratadas con PA, un aumento en los niveles de diversas proteínas involucradas con el control del tráfico endolisosomal y con la maduración autofágica, lo que podría explicar el mecanismo por el cual el PA afecta la autofagia en las neuronas hipotalámicas. Finalmente, se evaluó si la exposición al PA contribuye al desarrollo de desórdenes metabólicos, confirmando que el PA disminuye la sensibilidad a la insulina en las células hipotalámicas N43/5. Además, tanto la inhibición de la autofagia como del flujo autofágico redujeron la sensibilidad a la insulina en estas células. En resumen, este estudio sugiere que, en células neuronales hipotalámicas, la inhibición del flujo autofágico inducida por PA desregula el tráfico endolisosomal y reduce la sensibilidad a la insulina. Este estudio puede ayudar a dilucidar los mecanismos celulares que subyacen a los efectos del PA en la promoción de trastornos metabólicos asociados con la obesidad.
Papel de las fosfatasas STEP y PTEN en el balance entre la señalización sináptica y extrasináptica de los receptores NMDA en el hipocampo en un modelo murino de trauma cerebral moderado : papel del daño oxidativo.
(2020) Carvajal Cachaña, Francisco Javier; Cerpa Nebott, Waldo Francisco; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El daño neuronal provocado por lesiones cerebrales, envejecimiento o diversas enfermedades neurodegenerativas, tiene entre alguno de sus factores comunes la falla sináptica y el estrés oxidativo. El principal tipo de sinapsis afectada en este conjunto de patologías es la sinapsis glutamatérgica. Uno de los componentes principales de la transmisión glutamatérgica son los receptores de N-metil-D-aspartato (NMDARs). De acuerdo a su localización en subdominios de la membrana neuronal se han descrito dos poblaciones de NMDARs; los NMDARs sinápticos y los NMDARs extrasinápticos. Los NMDARs sinápticos son los encargados de la transmisión sináptica en diversos circuitos neuronales activando vías de señalización asociadas a la plasticidad sináptica y la sobrevida neuronal. Por el contrario, los NMDARs extrasinápticos, al ser activados, son capaces de generar cascadas de señalización intracelulares pro-apoptóticas incluyendo la activación de proteasas como las calpaínas. La localización de los NMDARs depende principalmente del estado de fosforilación de la subunidad GluN2B. Estudios previos han demostrado el papel de algunas fosforilaciones clave que ayudan a mantener al receptor en distintas zonas. Algunas fosforilaciones de interés son la fosforilación en la tirosina 1472 de la subunidad GluN2B que ha sido asociada a un enriquecimiento de los NMDARs en la zona sináptica y la fosforilación en la tirosina 1336, esta última ha sido relacionada a un enriquecimiento de los NMDARs en la zona extrasináptica. El balance entre estas dos fosforilaciones con funciones antagónicas depende del balance entre la actividad de kinasas y fosfatasas. En los últimos años se han descritos una serie de fosfatasas reguladoras de la actividad sináptica, muchas de ellas tienen como blanco a los NMDARs. En este trabajo las fosfatasas a estudiar son PTEN (Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome Ten) y STEP (Striatal-enriched protein Tyrosine Phosphatase), ambas proteínas tienen implicancias en la disminución de la actividad de los NMDARs en condiciones patológicas, así como también han sido involucradas como reguladores de la plasticidad sináptica en paradigmas de inducción de la potenciación y depresión a largo plazo (LTP y LTD respectivamente). Estos fenómenos han convertido a estas dos fosfatasas en un interesante blanco de estudio en eventos celulares relacionados a procesos neuropatológicos. En este trabajo hemos evaluado el papel del daño oxidativo en la regulación de la actividad de estas fosfatasas y de su efecto sobre el estado de fosforilación de los NMDARs bajo dos modelos diferentes. Daño oxidativo crónico y daño oxidativo agudo. En ambos casos se utilizó un animal transgénico con baja capacidad antioxidante como es el ratón heterocigoto para la enzima superóxido dismutasa 2 (SOD2-/+). Para evaluar el papel de PTEN y STEP en la distribución de los NMDARs por el daño oxidativo crónico, se utilizaron animales SOD2+/- de distintas edades (2 y 6 meses de edad), esperando que el envejecimiento y la baja capacidad antioxidante generen el daño oxidativo crónico. Como modelo de daño oxidativo agudo se utilizó un modelo de trauma de impacto craneal frontal leve y repetitivo en ratones SOD2+/- y ratones control. En ambos modelos se midieron los siguientes parámetros: cambios cognitivos (laberinto acuático de Morris y reconocimiento de objeto nuevo), estudios electrofisiológicos (LTP, potenciales dependientes de NMDARs) y la actividad y expresión de PTEN y STEP. Además, se evaluó la localización de los NMDARs a través de las fosforilaciones de la subunidad GluN2B y mediante fraccionamiento subcelular del hipocampo de estos ratones. Con el fin de corroborar la participación de las fosfatasas PTEN y STEP en la progresión del daño producido por el trauma cerebral y el posterior daño neuronal provocado entre otras cosas por el aumento de los NMDARs extrasinápticos, se utilizaron herramientas farmacológicas. Para el caso de PTEN se utilizó el inhibidor VO-OHpic y para STEP se utilizó el inhibidor TC-2153, en ambos casos se administró el inhibidor vía intraperitoneal antes de cada sesión de golpes. Solo con el inhibidor de STEP se contrarrestaron algunos de los efectos producidos por el trauma cerebral. En resumen, se logró establecer bajo dos modelos de acumulación de daño oxidativo, crónico y agudo, el papel de las fosfatasas STEP y PTEN en el estado de fosforilación y en la localización de los NMDARs entre regiones sinápticas y extrasinápticas, los cuales contribuirían a los daños neurológicos y sinápticos observados.
Los plasticidas Bisfenol-A y Nonilfenol inducen apoptosis de células germinales durante la espermatogénesis a través de un mecanismo dependiente de la ADAM17.
(2013) Lagos Cabré, Raúl Cristián; Moreno Mauro, Ricardo D.; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Los xenoestrógenos son moléculas con actividad estrogénica y antiandrogénica, que pueden interferir en procesos biológicos como la espermatogénesis, aumentando la apoptosis de las células germinales. El bisfenol-A y el 4-nonilfenol son dos xenoestrógenos que se encuentran abundantemente en el medio ambiente y que producen muerte de las células germinales en los testículos de rata. Además, estos compuestos afectan negativamente a los niveles hormonales y las características sexuales secundarias de los animales y humanos, las que pueden ser heredadas a la progenie, demostrando, también, que poseen efectos transgeneracionales. La espermatogénesis es el proceso por el cual se generan los espermatozoides, gametos masculinos, a partir de una célula diploide llamada espermatogonia y culmina con la liberación de un espermatozoide especializado, haploide pero sin motilidad, la que se adquiere en el epidídimo. Este proceso es especialmente sensible a los xenoestrógenos y los efectos negativos de estos compuestos sobre la espermatogénesis han sido ampliamente documentados. Sin embargo, sólo unos pocos artículos detallan algunos mecanismos que pueden ser activados por dichos xenoestrógenos. El objetivo de esta tesis es determinar qué mecanismos están involucrados en la muerte de las células germinales inducida por xenoestrógenos. En este sentido, a partir de datos preliminares de nuestro laboratorio e información publicada por otros grupos, proponemos que las proteínas de la familia ADAM participan en los efectos negativos provocados por los xenoestrógenos. Las proteínas ADAMs son metaloproteasas de la membrana celular, que tienen la función de liberar los ectodominios de sustratos al medio externo desde la membrana plasmática y modificar la matriz extracelular. La actividad de algunos miembros de la familia ADAM se relaciona con la muerte por apoptosis, que ocurre durante la espermatogénesis, y es sabido que estas metaloproteasas son activadas por distintos estímulos externos, como drogas, estrés oxidativo, proteínas quinasas y aumento de la concentración de ion calcio intracelular ([Ca2+]i). El miembro más estudiado y ubicuo de esta familia es la ADAM17, la cual está relacionada con la apoptosis de células germinales activada con etopósido, una droga anti cancerígena. Hemos probado que en el modelo utilizado (Rata) responde a los xenoestrógenos, ya que aumentó la muerte de células germinales en testículos de rata de 21 días de edad, que corresponde a ratas prepuberales, siendo un modelo excelente para el estudio del efecto de los xenoestrógenos debido a que estos compuestos actúan en ciertas etapas del desarrollo afectando de mayor manera el tracto reproductivo. Además, observamos que aumentan las especies reactivas de oxígeno (ROSs) en testículos de rata tratadas con xenoestrógenos, lo que concuerda con datos expuestos en la literatura. La inhibición farmacológica de la ADAM17 previno significativamente la muerte inducida por estos xenoestrógenos, sugiriendo que esta metaloproteasa participa en este mecanismo. Las ROSs generadas por los xenoestrógenos pueden ser en parte responsables de la muerte celular inducida por xenoestrógenos, ya que en células tratadas con antioxidantes la apoptosis disminuye, al igual que lo observado con la inhibición de p38MAPK, la cual reduce significativamente la muerte celular inducida por xenoestrógenos. Los niveles proteicos de la ADAM17 no cambiaron en presencia de xenoestrógenos, sugiriendo que los xenoestrógenos podrían actuar aumentando la actividad de la ADAM17. Para comprobar esto, estudiamos la localización de la ADAM17 en la superficie celular, ya que es una buena aproximación a la activación de esta metaloproteasa, debido a que sólo la ADAM17 activa se localiza en membrana. Observamos que efectivamente aumenta la localización de la ADAM17 en la superficie de las células germinales aisladas, lo que fue dependiente de la activación de p38MAPK. Esta interpretación fue apoyada por resultados obtenidos en células transfectadas con un sustrato de la ADAM17 acoplado a fosfatasa alcalina, lo que permite estudiar de forma indirecta la actividad de la ADAM17, mediante la medición de la actividad fosfatasa en el medio de cultivo. Los resultados fueron consistentes con los de la ADAM17 en la superficie celular. Para identificar el mecanismo que activa la ADAM17, propusimos estudiar si los aumentos de la [Ca2+]i producido por los xenoestrógenos participan en la activación de la ADAM17. Observamos que la ADAM17 responde al aumento de la [Ca2+]i inducido con un ionóforo de Ca2+, y que la actividad de la ADAM17 disminuye en presencia de quelantes de Ca2+ o del uso de una solución extracelular libre de Ca2+. Los xenoestrógenos aumentan la [Ca2+]i por un mecanismo que puede involucrar ingreso de Ca2+ desde el exterior o liberación de Ca2+ de reservorios intracelulares. Nuestros resultados muestran que la ADAM17 responde al ingreso y no a la liberación de Ca2+ de reservorios internos. Por esto, decidimos estudiar si este ingreso de Ca2+ podría estar mediado por hemicanales formados por pannexinas, los que son permeables a Ca2+, por lo tanto podrían mediar aumentos en la [Ca2+]i debido a que están acopladas a receptores P2X. La activación de la ADAM17 inducida por xenoestrógenos no se relacionó con un aumento en la permeabilidad de los hemicanales formados por pannexinas, debido a que los inhibidores de estos no redujeron la actividad de la ADAM17 ni su localización en membrana. Aún así, nuestros resultados avalan la participación de la ADAM17 como un nuevo miembro del mecanismo de la muerte celular inducida por xenoestrógenos, un proceso dependiente de la p38MAPK y estrés oxidativo.
Quasispecies diversity and its role in the virulence of the human influenza A virus.
(2019) Almonacid Cárdenas, Leonardo Iván; Medina, Rafael; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El virus de influenza estacional infectan entre el 5 y el 15% de la población humana cada año, lo que resulta en ∼500,000 muertes en todo el mundo. El virus de influenza estacional está asociada con dos tipos de virus de influenza: A (IAV) y B (IBV). Los virus de influenza pertenecen a la familia de virus Orthomyxoviridae que tienen genomas de ARN de sentido negativo, monocatenarios y segmentados. La segmentación del genoma, permite que el virus intercambie segmentos enteros con otras cepas, lo que facilita los saltos zoonóticos y aumenta la evolución y diversidad viral. Además, debido su polimerasa es propensa a errores debido a su falta de capacidad de corrección, se puede generar una diversidad considerable durante la replicación viral, que genera cambios graduales de nucleótidos que pueden acumularse con el tiempo. Estas fuentes de diversidad son fundamentales para la evolución del virus de la influenza y se han relacionado con marcadores que aumentan la patogénesis. La aparición de cepas pandémicas, las epidemias anuales y las variantes resisitentes a antivirales son ejemplos de cómo la diversidad genética impacta en la virulencia del patógeno. La diversidad de IAV, su arquitectura segmentada, el tamaño de la población y las coinfecciones generan las condiciones para que puedan ocurrir interacciones entre variantes genéticas. En este contexto, la teoría de las cuasiespecies puede contribuir a nuestra comprensión de la dinámica que puede surgir durante las infecciones por IAV. Las cuasiespecies virales se definen como la colección de genomas virales relacionados, sujetos a procesos continuos de variación genética, competencia y selección de la distribución con mayor “fitness”. En el modelo propuesto, tales interacciones entre los miembros de una cuasiespecie alcanzan un estado donde coexisten en un cuasi equilibrio que, en general, beneficia a toda la población. El desarrollo y las mejoras de las tecnologías de secuenciación, generando lecturas más largas y mayor profundidad, brindan nuevas oportunidades para estudiar las cuasiespecies virales. La mayor parte de la investigación se ha centrado en la validación experimental de conceptos introducidos por la teoría de la quasiespecie (es decir, umbral de error, robustez mutacional); para el IAV no existe una descripción clara ni una definición pragmática de las cuasiespecies en el contexto de una infección natural y su posible papel en la patogénesis. En esta tesis, investigamos si la diversidad de cuasiespecies virales modulan la virulencia de IAV. En primer lugar, para comprender mejor la diferencia entre las variantes de virus desde un enfoque funcional, desarrollamos un pipeline bioinformático. El IAV es un patógeno que ha captado la atención de los investigadores durante décadas, y como resultado de eso, hay una cantidad importante y una gran variedad de información. Para la mayoría de sus proteínas se cuenta con una o más estructuras de cristalografía y hay descripciones precisas con evidencia experimental que asocian funciones a diferentes regiones de cada proteína. Nuestro pipeline utiliza esta información resaltando las diferencias de nucleótidos en comparación con una secuencia de consenso, lo que proporciona una mejor comprensión de las funciones de la proteína que podrían verse afectadas en comparación con la secuencia de consenso. En segundo lugar, utilizamos este pipeline para analizar las variantes virales observadas en las secuencias de IAV obtenidas de individuos graves. Esto nos permitió identificar un nuevo aminoácido en la NA que confiere resistencia al antiviral oseltamivir. También identificamos cambios en la HA que probablemente ayuden a evadir la inmunidad preexistente (respuestas de anticuerpos) en un sujeto en particular, lo que sugiere que se trata de una deriva antigénica intra-huésped. Además, estos cambios se detectaron como poblaciones mixtas en muestras secuenciales, lo que indica un cambio dinámico en el tiempo del genoma de IAV. Finalmente, describimos la diversidad de las cuasiespecies experimentalmente in vitro e in vivo en humanos. Usando una combinación de los métodos de secuenciación Illumina y PacBio, medimos las poblaciones virales durante el curso de la infección cuando el IAV se pasó en diferentes sustratos celulares hasta 10 veces. Nuestros análisis revelaron la presencia de un número limitado de variantes IAV, que fluctuaron a lo largo de los pasajes y las réplicas biológicas. La mayoría de las variaciones de un solo nucleótido (SNV) se encontraron a baja frecuencia y rara vez se compartieron entre las réplicas. Sin embargo, encontramos SNV que se fijaron en los ultimos pasajes y, casi siempre, conllevaron un cambio de aminoácidos. Los datos sugieren que, típicamente, había un único genotipo dominante. La diversidad genética se evaluó en individuos infectados con IAV pertenecientes a un grupo severo o a uno no severo. Nuestros análisis genómicos indican una tendencia a tener más SNV en el grupo severo que en el no severo. En el grupo severo, solo el 25% de los SNV fueron de ocurrencia única en un segmento, mientras que el 45% en los no severos, lo que sugiere una dinámica genética diferente entre los dos grupos. Al igual que lo sucedido in vitro, generalmente un genotipo es el dominante en cada paciente. Nuestros resultados indican que las diversidad en las cuasiespecies alcanzarón altos niveles en casos particulares, pero a modo general para cada segemento, no hubo diferencias en diversidad entre el grupo grave y el no grave. Adicionalmente, se encontraron haplotipos alternativos con alta frecuencia en experimentos in vitro e in vivo, pero según los datos obtenidos de los pasajes celulares, es muy probable que sea un estado transitorio. Por lo tanto, esta investigación contribuye a la comprensión de cómo se generan las cuasiespecies y sugiere que los factores del sustrato y / o huésped, probablemente contribuyan a la diversidad viral intrínseca y a la capacidad de replicación.
Rol de la insulina interoceptiva en la regulación de la memoria de miedo
(2015) Casanova Castillo, José Patricio; Torrealba, Fernando; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La Corteza Insular (CI) recibe y procesa información interoceptiva proveniente del cuerpo. La CI parece estar involucrada en la percepción del estado visceral que subyace a las conductas destinadas a preservar la homeostasis. En este sentido, la CI ha sido implicada tanto en la percepción de estados corporales (interocepción) como en la experiencia emocional. A la fecha, existen pocos estudios que investigan el rol de la CI en la percepción de estados corporales y emocionales en ratas despiertas en libre movimiento, y ninguno de ellos ha investigado la contribución de la interocepción a las respuestas conductuales relacionadas a emociones. Nuestra hipótesis plantea que la actividad de la región interoceptiva de la ínsula de la rata está involucrada en el control de las respuestas autonómicas y conductuales a estímulos interoceptivos y emocionales. Para resolver este asunto, realizamos tres estudios cuyos resultados apoyan nuestra hipótesis.El primer estudio se orientó a evaluar la contribución de la CI a las respuestas conductuales y autonómicas frente a la hipoxia. Usamos inactivaciones locales de la CI en ratas que fueron sometidas a hipoxia aguda. Encontramos que la respuesta autonómica a la hipoxia estaba exacerbada en aquellas ratas cuya CI fue inactivada, las cuales también mostraron una mayor latencia a desplegar conducta de escape, lo que sugiere un rol regulador de la CI en la respuesta autonómica a la hipoxia. El segundo y tercer estudio fueron realizados para determinar el rol de la CI en el miedo condicionado. Utilizamos condicionamiento auditivo clásico, manipulaciones farmacológicas de la CI pre y post condicionamiento, y registro de unidades individuales de la CI en ratas en libre movimiento durante la expresión de miedo condicionado. Encontramos que un 23% de las neuronas registradas cambió su frecuencia de descarga asociado a la expresión de miedo (freezing), y que estas respuestas se reducen con la extinción del miedo condicionado. Asimismo, estas respuestas se correlacionaron con el curso temporal de la conducta de freezing. El tercer estudio mostró que la inactivación y supresión de la síntesis de proteínas en la CI luego del condicionamiento del miedo, produjo una marcada reducción en la expresión de miedo, sugiriendo un papel para la CI en la consolidación de una memoria de miedo. Estos datos muestran que la expresión de freezing condicionado se acompaña de cambios en la actividad de la CI, y sugieren que la CI regula la expresión de memorias de miedo. En resumen, nuestros tres estudios proveen datos que muestran que la CI está funcionalmente involucrada en la regulación de respuestas autonómicas, en el aprendizaje de respuestas emocionales y, probablemente, en la percepción del miedo.
La señalización de la quinasa Abl1 restringe la expresión de un programa de genes sinápticos relacionado con la memoria y el aprendizaje.
(2019) González Martín, Adrián; Álvarez Rojas, Alejandra; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Mediante la memoria y el aprendizaje somos capaces de adquirir, almacenar y recuperar nueva información a lo largo de nuestra vida. Hoy se sabe que para que se forme la memoria es necesaria la modificación de la comunicación entre las neuronas, bien remodelando las espinas existentes o formando nuevas espinas. Para ello, se requiere una regulación tanto a nivel proteico como a nivel genético. Actualmente, se conocen factores de transcripción muy ligados a los procesos de memoria y aprendizaje, como; CREB, MEF2, Npas4 o SRF, entre otros. Además, ha tomado gran relevancia la regulación génica a través de modificaciones epigenéticas, llevadas a cabo, principalmente, por las enzimas HAT y HDAC. La actividad de HDAC2, por ejemplo, regula negativamente la formación de memoria y la plasticidad sináptica. Nosotros hemos descrito que la quinasa ABL1, es capaz de regular factores de transcripción como p73 o TFEB, así como a la HDAC2. La activación de esta última, por ABL1, reprime la expresión de genes sinápticos, como; la sinaptofisina, la sinaptotagmina o subunidades de los AMPAR y NMDAR. Además, el uso de Imatinib para inhibir la activación de ABL1, puede revertir la activación de la HDAC2 y, por tanto, permitir la expresión de genes fundamentales para la comunicación sináptica. A pesar de estos nuevos conocimientos, se desconoce el grupo de genes que se están regulando y que pueden determinar la correcta formación y mantenimiento de la memoria. Basándonos en los antecedentes presentados, nos planteamos la siguiente hipótesis: “La ausencia de ABL1 mejora la memoria y el aprendizaje regulando la expresión de genes involucrados en la plasticidad sináptica”. Para comprobar nuestra hipótesis, primero evaluamos in vivo, si la ausencia de ABL1 en el SNC tenía efectos cognitivos. Para ello, realizamos los tests de MWM, BM y NOR, que evalúan memoria y aprendizaje dependiente del hipocampo. Observamos que los ratones nulos de ABL1 tenían un aprendizaje más rápido y una mayor consolidación de la memoria que los controles. Lo que indicaría que ABL1 participa en la regulación de ambos procesos. A continuación, evaluamos si ABL1 estaría regulando la expresión de genes involucrados con los cambios cognitivos. Así, secuenciamos el RNA hipocampal de ratones nulos de ABL1 y sus respectivos controles, en ambos casos en estado basal y tras un entrenamiento de aprendizaje. Los resultados mostraron que los ratones nulos de ABL1 con aprendizaje presentaban un mayor número de genes con expresión diferencial respecto a los controles durante el aprendizaje que durante el estado basal, por lo que el efecto de ABL1 era debido al aprendizaje. Además, nuestros análisis determinaron que de los genes con una sobreexpresión diferencial por aprendizaje, casi dos tercios pertenecían a los ratones nulos de ABL1, los cuales pertenecen a ontologías relacionadas con la plasticidad sináptica y la regulación del citoesqueleto. Por otro lado, confirmamos mediante RT-qPCR la expresión diferencial de algunos de los genes relacionados con la morfología y plasticidad sináptica. Evaluamos si también había cambios en los niveles proteicos, de dos de los genes seleccionamos, Atad1 y Actr2 que tienen un papel muy importante en la plasticidad funcional y morfológica de las espinas, respectivamente. Ambas proteínas mostraron un aumento en los ratones nulos de ABL1 tras el aprendizaje. Para analizar in vitro los resultados obtenidos, utilizamos cultivos neuronales. Tras inhibir la activación de ABL1 con Imatinib, se hizo un estímulo químico de LTD o LTP para evaluar tanto los niveles de transcrito como proteicos de Arp2 y Thorase. En ambos casos aumentaron significativamente tras la generación de un LTP. Del mismo modo, la inhibición de ABL1 mediante el uso de su shRNA nos permitió observar como la polimerización del citoesqueleto de actina, controlada principalmente por Arp2, estaba siendo incrementada tras el LTP con respecto al control sc-shRNA. Por último, evaluamos si, según las ontologías enriquecidas en nuestro análisis, había cambios en las espinas de los ratones sometidos a aprendizaje. Mediante la tinción de Golgi-Cox pudimos clasificar y cuantificar espinas individuales, observando como la ausencia de ABL1 aumentaba su densidad y las de tipos más maduros tras el aprendizaje. Estas observaciones se correlacionan con sinapsis más estables y eficaces, requisitos indispensables para la formación de la memoria a largo plazo. Todos estos resultados indican que ABL1 esta jugando un rol determinante en los procesos de memoria y aprendizaje, regulando la expresión de genes sinápticos y de remodelación del citoesqueleto, reflejándose en la morfología y densidad de las espinas de los ratones nulos para ABL1 tras el aprendizaje. Además, la inhibición farmacológica de ABL1 aparece como una posible vía para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas que involucren deterioro cognitivo.

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