BIO Tesis doctorado

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Browsing BIO Tesis doctorado by Author "Barrera Rojas, Nelson Patricio"

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    Caracterización biomecánica del proceso de NETosis en suspensión
    (2022) Morales Camilo, Nicole; Barrera Rojas, Nelson Patricio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
    Las NETs son fibras de cromatina descondensada que forman una red compuesta mayoritariamente por ADN e histonas y proteínas antimicrobiales, consecuencia del mecanismo de muerte celular programada llamada NETosis, para la generación de una barrera física que previene la diseminación de patógenos. La NETosis es un proceso dinámico que implica transformaciones significativas en el citoesqueleto y el núcleo celular, y con ello, cambios significativos en las propiedades mecánicas celulares; sin embargo, la caracterización de este proceso en un contexto cercano al fisiológico no ha sido abordado. Este trabajo busca estudiar la biomecánica del proceso de NETosis en suspensión utilizando una aproximación interdisciplinaria. Para medir los cambios morforeológicos del proceso de NETosis en flujo se adaptó la metodología de RT-DC y determinó el módulo de Young (elasticidad) de los neutrófilos estimulados. El RT-DC corroboró que la NETosis inducida por PMA es independiente al proceso de adhesión, en condiciones de flujo. Así también, el análisis de los gráficos área versus deformación obtenidos por el RT-DC, permitió la clasificación y caracterización de subpoblaciones celulares, y comprobar la generación de NETs en suspensión. Finalmente, la caracterización morforeológica de estos neutrófilos muestran un aumento significativo en su tamaño celular (>30 µm2) y cambios de elasticidad con una fase inicial “rápida” de aumento en la rigidez y luego una fase “lenta” de disminución de la rigidez. Este estudio proporcionó evidencia necesaria para relacionar las características biomecánicas de la NETosis con el mecanismo molecular y la temporalidad descrita para este proceso, en un contexto cercano al fisiológico.
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    Characterization of neutrophils subpopulation produced in response to Streptococcus pneumoniae infection in a murine model
    (2025) Silva Rodríguez, Pedro Hugo; Barrera Rojas, Nelson Patricio; Bueno Ramírez, Susan; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
    Streptococcus pneumoniae es una bacteria Gram-positivo y la principal causa de neumonía bacteriana en todo el mundo, afectando principalmente a infantes y personas de edad avanzada. El ciclo infeccioso de esta bacteria comienza con la colonización del tracto respiratorio superior, seguida por la infección del tracto respiratorio inferior. Allí, la bacteria entra en contacto con células epiteliales e inmunes, lo que desencadena la respuesta inmune y el proceso inflamatorio en los pulmones. Los neutrófilos son células inmunes granulocíticas de vida corta y forman parte de la primera línea de defensa del organismo. En la respuesta inmune generada en los pulmones, los neutrófilos desempeñan un papel crucial en la eliminación del patógeno a través de fagocitosis, degranulación y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs). Sin embargo, estudios recientes han demostrado que los neutrófilos también son capaces de controlar la inflamación excesiva en infecciones respiratorias mediante la liberación de citoquinas antiinflamatorias, como IL10. Además, cada vez hay más evidencia de que los neutrófilos son altamente heterogéneos, lo que podría tener consecuencias desconocidas en la progresión de la enfermedad. En este contexto, se han identificado subpoblaciones de neutrófilos en pulmones de ratones sanos e infectados con Streptococcus pneumoniae denominadas FSChigh y FSClow. Sin embargo, aún no está claro si estas subpoblaciones tienen roles específicos durante la infección o funciones de la respuesta inmune. Basado en esto, la hipótesis de esta tesis es que, los neutrófilos de médula ósea de ratón son intrinsecamente heterogéneos y que durante la etapa temprana de la infección por Streptococcus pneumoniae existen dos subpoblaciones de neutrófilos con funciones distintas, donde la proporción de estas subpoblaciones cambia en el tiempo. Para evaluar la hipótesis, primero determinamos la cinética de reclutamiento de las subpoblaciones de neutrófilos en los tiempos iniciales, concluyendo que a las 12 hpi hay un aumento significativo de las subpoblaciones de neutrófilos en los pulmones. Además, evaluamos el patrón de marcadores de membrana en neutrófilos purificados de la médula ósea y observamos que, incluso después de la aislamiento y sin tratamiento, los neutrófilos son altamente heterogéneos y pueden agruparse según sus patrones de marcadores de membrana. Posteriormente, para determinar si ambas subpoblaciones de neutrófilos tienen funciones específicas, aislamos ambas subpoblaciones a las 12 y 24 hpi desde los pulmones y realizamos un análisis de RNA-seq. Los resultados indican que los neutrófilos FSChigh aumentan vías celulares asociadas a la degranulación y la formación de NETs; sin embargo, no fue posible analizar el RNA de los neutrófilos FSClow. Un RNA-seq realizado en neutrófilos totales purificados de pulmón mostró que el perfil transcriptómico es diferente a lo observado en los neutrófilos FSChigh por sí solos, donde funciones como la degranulación están disminuidas. Sin embargo, debido a que se utilizaron distintas metodologías para aislar los neutrófilos, no es posible atribuir estas diferencias solo a la presencia/ausencia de los neutrófilos FSClow. En conjunto, estos resultados concuerdan con las hipótesis propuesta y muestran la plasticidad de los neutrófilos durante las infecciones bacterianas.
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    Determinación del crosstalk estructural entre los receptores de membrana 5-HT3a y P2X4 mediante microscopía de fuerza atómica.
    (2020) Soto Sepúlveda, Paola Andrea; Barrera Rojas, Nelson Patricio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
    Los receptores ionotrópicos 5-HT3 y P2X representan dos tipos diferentes de canales iónicos activados por ligando, tanto estructural como funcionalmente. Desde el punto de vista fisiológico, cabe señalar que ambos receptores se expresan en el sistema nervioso central y periférico, pero es en el sistema nervioso central donde la participación de ambos receptores es importante, ya que participan en una serie de patologías como enfermedades neurodegenerativas y dolor neuropático. Aunque se ha demostrado el crosstalk funcional entre receptores ionotrópicos; aún se desconoce cómo los receptores 5-HT3a pueden interactuar directamente con los receptores P2X, específicamente con P2X4 y si esto depende de la presencia de agonistas como ATP. Se transfectó las células tsA 201 con pDNA de los receptores 5-HT3a y P2X4, marcados con los tags Myc/His-6 y HA respectivamente. La presencia del complejo 5-HT3a-P2X4 se analizó por inmunofluorescencia y western blot. Se obtuvo imágenes topográficas de los complejos 5- HT3a-P2X4 por microscopía de fuerza atómica (AFM) para determinar su estequiometría. Se observó una distribución de partículas polidispersa que sugiere dos poblaciones, una de ellas, la de menor volumen molecular sugiere la presencia de proteínas aisladas, en cambio la población de mayor volumen molecular sugiere la presencia de un complejo de proteínas con una estequiometría 1:1, cuya abundancia aumenta en presencia de ATP. Se determinó que la activación de P2X4 mediante ATP aumenta el nivel de calcio intracelular que es inhibido por el receptor 5-HT3a. Pre-incubación con PPADS, antagonista del receptor P2X4, inhibe el aumento de calcio del receptor P2X4 cuando está aislado o formando complejo. Mediante AFM de alta velocidad (HS-AFM) se observó en tiempo real la interacción física, probablemente entre los receptores 5-HT3a y P2X4 insertos en liposomas. Estos hallazgos proporcionan información sobre la arquitectura molecular del complejo de receptores 5-HT3a-P2X4 y nuevos antecedentes biofísicos sobre la regulación del crosstalk estructural entre receptores ionotrópicos.Los receptores ionotrópicos 5-HT3 y P2X representan dos tipos diferentes de canales iónicos activados por ligando, tanto estructural como funcionalmente. Desde el punto de vista fisiológico, cabe señalar que ambos receptores se expresan en el sistema nervioso central y periférico, pero es en el sistema nervioso central donde la participación de ambos receptores es importante, ya que participan en una serie de patologías como enfermedades neurodegenerativas y dolor neuropático. Aunque se ha demostrado el crosstalk funcional entre receptores ionotrópicos; aún se desconoce cómo los receptores 5-HT3a pueden interactuar directamente con los receptores P2X, específicamente con P2X4 y si esto depende de la presencia de agonistas como ATP. Se transfectó las células tsA 201 con pDNA de los receptores 5-HT3a y P2X4, marcados con los tags Myc/His-6 y HA respectivamente. La presencia del complejo 5-HT3a-P2X4 se analizó por inmunofluorescencia y western blot. Se obtuvo imágenes topográficas de los complejos 5- HT3a-P2X4 por microscopía de fuerza atómica (AFM) para determinar su estequiometría. Se observó una distribución de partículas polidispersa que sugiere dos poblaciones, una de ellas, la de menor volumen molecular sugiere la presencia de proteínas aisladas, en cambio la población de mayor volumen molecular sugiere la presencia de un complejo de proteínas con una estequiometría 1:1, cuya abundancia aumenta en presencia de ATP. Se determinó que la activación de P2X4 mediante ATP aumenta el nivel de calcio intracelular que es inhibido por el receptor 5-HT3a. Pre-incubación con PPADS, antagonista del receptor P2X4, inhibe el aumento de calcio del receptor P2X4 cuando está aislado o formando complejo. Mediante AFM de alta velocidad (HS-AFM) se observó en tiempo real la interacción física, probablemente entre los receptores 5-HT3a y P2X4 insertos en liposomas. Estos hallazgos proporcionan información sobre la arquitectura molecular del complejo de receptores 5-HT3a-P2X4 y nuevos antecedentes biofísicos sobre la regulación del crosstalk estructural entre receptores ionotrópicos.Los receptores ionotrópicos 5-HT3 y P2X representan dos tipos diferentes de canales iónicos activados por ligando, tanto estructural como funcionalmente. Desde el punto de vista fisiológico, cabe señalar que ambos receptores se expresan en el sistema nervioso central y periférico, pero es en el sistema nervioso central donde la participación de ambos receptores es importante, ya que participan en una serie de patologías como enfermedades neurodegenerativas y dolor neuropático. Aunque se ha demostrado el crosstalk funcional entre receptores ionotrópicos; aún se desconoce cómo los receptores 5-HT3a pueden interactuar directamente con los receptores P2X, específicamente con P2X4 y si esto depende de la presencia de agonistas como ATP. Se transfectó las células tsA 201 con pDNA de los receptores 5-HT3a y P2X4, marcados con los tags Myc/His-6 y HA respectivamente. La presencia del complejo 5-HT3a-P2X4 se analizó por inmunofluorescencia y western blot. Se obtuvo imágenes topográficas de los complejos 5- HT3a-P2X4 por microscopía de fuerza atómica (AFM) para determinar su estequiometría. Se observó una distribución de partículas polidispersa que sugiere dos poblaciones, una de ellas, la de menor volumen molecular sugiere la presencia de proteínas aisladas, en cambio la población de mayor volumen molecular sugiere la presencia de un complejo de proteínas con una estequiometría 1:1, cuya abundancia aumenta en presencia de ATP. Se determinó que la activación de P2X4 mediante ATP aumenta el nivel de calcio intracelular que es inhibido por el receptor 5-HT3a. Pre-incubación con PPADS, antagonista del receptor P2X4, inhibe el aumento de calcio del receptor P2X4 cuando está aislado o formando complejo. Mediante AFM de alta velocidad (HS-AFM) se observó en tiempo real la interacción física, probablemente entre los receptores 5-HT3a y P2X4 insertos en liposomas. Estos hallazgos proporcionan información sobre la arquitectura molecular del complejo de receptores 5-HT3a-P2X4 y nuevos antecedentes biofísicos sobre la regulación del crosstalk estructural entre receptores ionotrópicos.Los receptores ionotrópicos 5-HT3 y P2X representan dos tipos diferentes de canales iónicos activados por ligando, tanto estructural como funcionalmente. Desde el punto de vista fisiológico, cabe señalar que ambos receptores se expresan en el sistema nervioso central y periférico, pero es en el sistema nervioso central donde la participación de ambos receptores es importante, ya que participan en una serie de patologías como enfermedades neurodegenerativas y dolor neuropático. Aunque se ha demostrado el crosstalk funcional entre receptores ionotrópicos; aún se desconoce cómo los receptores 5-HT3a pueden interactuar directamente con los receptores P2X, específicamente con P2X4 y si esto depende de la presencia de agonistas como ATP. Se transfectó las células tsA 201 con pDNA de los receptores 5-HT3a y P2X4, marcados con los tags Myc/His-6 y HA respectivamente. La presencia del complejo 5-HT3a-P2X4 se analizó por inmunofluorescencia y western blot. Se obtuvo imágenes topográficas de los complejos 5- HT3a-P2X4 por microscopía de fuerza atómica (AFM) para determinar su estequiometría. Se observó una distribución de partículas polidispersa que sugiere dos poblaciones, una de ellas, la de menor volumen molecular sugiere la presencia de proteínas aisladas, en cambio la población de mayor volumen molecular sugiere la presencia de un complejo de proteínas con una estequiometría 1:1, cuya abundancia aumenta en presencia de ATP. Se determinó que la activación de P2X4 mediante ATP aumenta el nivel de calcio intracelular que es inhibido por el receptor 5-HT3a. Pre-incubación con PPADS, antagonista del receptor P2X4, inhibe el aumento de calcio del receptor P2X4 cuando está aislado o formando complejo. Mediante AFM de alta velocidad (HS-AFM) se observó en tiempo real la interacción física, probablemente entre los receptores 5-HT3a y P2X4 insertos en liposomas. Estos hallazgos proporcionan información sobre la arquitectura molecular del complejo de receptores 5-HT3a-P2X4 y nuevos antecedentes biofísicos sobre la regulación del crosstalk estructural entre receptores ionotrópicos.Los receptores ionotrópicos 5-HT3 y P2X representan dos tipos diferentes de canales iónicos activados por ligando, tanto estructural como funcionalmente. Desde el punto de vista fisiológico, cabe señalar que ambos receptores se expresan en el sistema nervioso central y periférico, pero es en el sistema nervioso central donde la participación de ambos receptores es importante, ya que participan en una serie de patologías como enfermedades neurodegenerativas y dolor neuropático. Aunque se ha demostrado el crosstalk funcional entre receptores ionotrópicos; aún se desconoce cómo los receptores 5-HT3a pueden interactuar directamente con los receptores P2X, específicamente con P2X4 y si esto depende de la presencia de agonistas como ATP. Se transfectó las células tsA 201 con pDNA de los receptores 5-HT3a y P2X4, marcados con los tags Myc/His-6 y HA respectivamente. La presencia del complejo 5-HT3a-P2X4 se analizó por inmunofluorescencia y western blot. Se obtuvo imágenes topográficas de los complejos 5- HT3a-P2X4 por microscopía de fuerza atómica (AFM) para determinar su estequiometría. Se observó una distribución de partículas polidispersa que sugiere dos poblaciones, una de ellas, la de menor volumen molecular sugiere la presencia de proteínas aisladas, en cambio la población de mayor volumen molecular sugiere la presencia de un complejo de proteínas con una estequiometría 1:1, cuya abundancia aumenta en presencia de ATP. Se determinó que la activación de P2X4 mediante ATP aumenta el nivel de calcio intracelular que es inhibido por el receptor 5-HT3a. Pre-incubación con PPADS, antagonista del receptor P2X4, inhibe el aumento de calcio del receptor P2X4 cuando está aislado o formando complejo. Mediante AFM de alta velocidad (HS-AFM) se observó en tiempo real la interacción física, probablemente entre los receptores 5-HT3a y P2X4 insertos en liposomas. Estos hallazgos proporcionan información sobre la arquitectura molecular del complejo de receptores 5-HT3a-P2X4 y nuevos antecedentes biofísicos sobre la regulación del crosstalk estructural entre receptores ionotrópicos.Los receptores ionotrópicos 5-HT3 y P2X representan dos tipos diferentes de canales iónicos activados por ligando, tanto estructural como funcionalmente. Desde el punto de vista fisiológico, cabe señalar que ambos receptores se expresan en el sistema nervioso central y periférico, pero es en el sistema nervioso central donde la participación de ambos receptores es importante, ya que participan en una serie de patologías como enfermedades neurodegenerativas y dolor neuropático. Aunque se ha demostrado el crosstalk funcional entre receptores ionotrópicos; aún se desconoce cómo los receptores 5-HT3a pueden interactuar directamente con los receptores P2X, específicamente con P2X4 y si esto depende de la presencia de agonistas como ATP. Se transfectó las células tsA 201 con pDNA de los receptores 5-HT3a y P2X4, marcados con los tags Myc/His-6 y HA respectivamente. La presencia del complejo 5-HT3a-P2X4 se analizó por inmunofluorescencia y western blot. Se obtuvo imágenes topográficas de los complejos 5- HT3a-P2X4 por microscopía de fuerza atómica (AFM) para determinar su estequiometría. Se observó una distribución de partículas polidispersa que sugiere dos poblaciones, una de ellas, la de menor volumen molecular sugiere la presencia de proteínas aisladas, en cambio la población de mayor volumen molecular sugiere la presencia de un complejo de proteínas con una estequiometría 1:1, cuya abundancia aumenta en presencia de ATP. Se determinó que la activación de P2X4 mediante ATP aumenta el nivel de calcio intracelular que es inhibido por el receptor 5-HT3a. Pre-incubación con PPADS, antagonista del receptor P2X4, inhibe el aumento de calcio del receptor P2X4 cuando está aislado o formando complejo. Mediante AFM de alta velocidad (HS-AFM) se observó en tiempo real la interacción física, probablemente entre los receptores 5-HT3a y P2X4 insertos en liposomas. Estos hallazgos proporcionan información sobre la arquitectura molecular del complejo de receptores 5-HT3a-P2X4 y nuevos antecedentes biofísicos sobre la regulación del crosstalk estructural entre receptores ionotrópicos.Los receptores ionotrópicos 5-HT3 y P2X representan dos tipos diferentes de canales iónicos activados por ligando, tanto estructural como funcionalmente. Desde el punto de vista fisiológico, cabe señalar que ambos receptores se expresan en el sistema nervioso central y periférico, pero es en el sistema nervioso central donde la participación de ambos receptores es importante, ya que participan en una serie de patologías como enfermedades neurodegenerativas y dolor neuropático. Aunque se ha demostrado el crosstalk funcional entre receptores ionotrópicos; aún se desconoce cómo los receptores 5-HT3a pueden interactuar directamente con los receptores P2X, específicamente con P2X4 y si esto depende de la presencia de agonistas como ATP. Se transfectó las células tsA 201 con pDNA de los receptores 5-HT3a y P2X4, marcados con los tags Myc/His-6 y HA respectivamente. La presencia del complejo 5-HT3a-P2X4 se analizó por inmunofluorescencia y western blot. Se obtuvo imágenes topográficas de los complejos 5- HT3a-P2X4 por microscopía de fuerza atómica (AFM) para determinar su estequiometría. Se observó una distribución de partículas polidispersa que sugiere dos poblaciones, una de ellas, la de menor volumen molecular sugiere la presencia de proteínas aisladas, en cambio la población de mayor volumen molecular sugiere la presencia de un complejo de proteínas con una estequiometría 1:1, cuya abundancia aumenta en presencia de ATP. Se determinó que la activación de P2X4 mediante ATP aumenta el nivel de calcio intracelular que es inhibido por el receptor 5-HT3a. Pre-incubación con PPADS, antagonista del receptor P2X4, inhibe el aumento de calcio del receptor P2X4 cuando está aislado o formando complejo. Mediante AFM de alta velocidad (HS-AFM) se observó en tiempo real la interacción física, probablemente entre los receptores 5-HT3a y P2X4 insertos en liposomas. Estos hallazgos proporcionan información sobre la arquitectura molecular del complejo de receptores 5-HT3a-P2X4 y nuevos antecedentes biofísicos sobre la regulación del crosstalk estructural entre receptores ionotrópicos.