Facultad de Ciencias Biológicas

Permanent URI for this community

https://repositorio.uc.cl/handle/11534/3285

Browse

Now showing 1 - 20 of 143

El ácido palmítico reduce la sensibilidad a insulina de neuronas hipotalámicas: rol de la autofagia y del receptor FFAR1/GPR40
(2022) Toledo Valenzuela, Lilian Alejandra; Morselli, Eugenia; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La diabetes mellitus tipo 2 es una compleja enfermedad metabólica caracterizada por una hiperglicemia crónica, que puede ser debida a una disminución en la sensibilidad a la insulina, a una reducción en su secreción o una combinación de ambas. El consumo de una dieta alta en grasas, abundante en ácido palmítico, favorece el desarrollo de esta enfermedad. El ácido palmítico disminuye la sensibilidad a la insulina en todo el organismo, incluyendo las neuronas hipotalámicas, que inhiben la producción de glucosa hepática (PGH) clave en la regulación de la glicemia. La acumulación hipotalámica de ácido palmítico reduce la supresión de la PGH, lo cual podría causar una menor sensibilidad a insulina en estos animales; sin embargo, esto aún no ha sido dilucidado. Respecto al mecanismo, se ha descrito que la activación por ácido palmítico del Receptor de Ácidos Grasos Libres 1 FFAR1/GPR40, disminuye la respuesta a la insulina en células β-pancreáticas, aunque no se ha evaluado si también reduce la sensibilidad a insulina en neuronas hipotalámicas, y si esto se traduce en una menor captación de glucosa mediada por insulina. Por otra parte, hemos demostrado que la autofagia, un proceso de degradación y reciclaje esencial para la homeostasis celular, se inhibe por la activación de FFAR1/GPR40 por ácido palmítico en neuronas hipotalámicas. La inhibición de la autofagia se asocia con una menor sensibilidad a la insulina en diversas células, por lo que resulta relevante evaluar si su bloqueo por ácido palmítico reduce la sensibilidad a la insulina en neuronas hipotalámicas. En base a la evidencia expuesta previamente, este proyecto está enfocado en determinar si el ácido palmítico, a través del receptor de ácidos grasos libres 1 (FFAR1/GPR40) y por medio de la inhibición de la autofagia, reduce la sensibilidad a la insulina en neuronas hipotalámicas. Por otro lado, queremos determinar si la infusión intracerebroventricular (ICV) de ácido palmítico reduce la sensibilidad a la insulina en ratones C57BL/6. Nuestros resultados muestran que el ácido palmítico reduce la sensibilidad a la insulina de las neuronas hipotalámicas por un mecanismo que incluye tanto la activación de FFAR1/GPR40 como defectos en la autofagia, reduciendo la activación de la vía PI3K/AKT y disminuyendo la captación de glucosa inducida por insulina en neuronas hipotalámicas. Finalmente, nuestros datos sugieren que la infusión hipotalámica de ácido palmítico reduce la tolerancia a la glucosa y disminuye los niveles plasmáticos de insulina en ratones C57BL/6. Este proyecto provee nueva información acerca de cómo el ácido palmítico favorece el desarrollo de diabetes mellitus tipo 2, dando énfasis en la función de FFAR1/GPR40 en las neuronas hipotalámicas y considerando a la autofagia como un mecanismo de regulación de la sensibilidad a insulina en estas células. Estos resultados podrían ser un precedente para futuros estudios enfocados en el rol de la autofagia en neuronas hipotalámicas y su relevancia en la regulación de la glicemia.
La actividad de la proteína quinasa M\03B6 se requiere para la ejecución de las conductas motivadas en el área del tegmento ventral.
(2013) Ibáñez Hormazábal, María Raquel; Gysling Caselli, Katia; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El Área del tegmento ventral (VTA) es una zona central en el sistema neuronal, llamado circuito de la motivación, que controla las respuestas de refuerzo a los estímulos naturales (tales como alimento) y a las drogas de abuso. El circuito de la motivación esta formado por VTA, Núcleo Accumbens y Corteza Pre-frontal, entre otras áreas. Se ha descrito que la activación de VTA induce una liberación de dopamina (DA) en los terminales presentes en Núcleo Accumbens y en otras áreas cerebrales. Esta liberación de DA ha sido altamente asociada al procesamiento de las recompensas. Todas las drogas de abuso activan, directa o indirectamente, las neuronas dopaminérgicas del VTA. Se ha descrito que esta activación genera cambios plásticos en el circuito. Estos cambios serían los responsables de generar las modificaciones del comportamiento inducidas por las drogas de abuso. Y además, serian necesarios para la repetición de la conducta en el tiempo. Se ha demostrado que los recompensantes naturales y las drogas de abuso inducen una potenciación a largo plazo en las neuronas dopaminérgicas del VTA.
ADAM17 participa en la apoptosis fisiológica e inducida por xenoestrógenos durante la espermatogénesis
(2015) Urriola Muñoz, Paulina Andrea; Moreno Mauro, Ricardo D.; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La apoptosis en células germinales es fundamental en la regulación de la producción diaria de espermatozoides, y se lleva a cabo tanto en condiciones fisiológicas como inducidas por agentes externos como lo son los genotóxicos, que dañan al DNA, y xenoestrógenos, que imitan a los estrógenos endógenos. Se sabe que los xenoestrógenos como Bisfenol A (BFA) y 4-Nonilfenol (NF) inducen un incremento del índice apoptótico en células de testículos de ratas y ratones y una baja producción de espermatozoides en estos animales. Sin embargo, el mecanismo que subyace a este efecto es desconocido. La ADAM17 (A Desintegrin And Metalloprotease-17) es una metaloproteasa de transmembrana relevante en la señalización paracrina/yuxtacrina y autocrina. En nuestro laboratorio se ha mostrado que la inhibición farmacológica de la ADAM17 disminuye la apoptosis de células germinales masculinas tanto en condiciones fisiológicas como en la inducida por drogas anticancerígenas y xenoestrógenos. Sin embargo, aún se desconoce si la presencia de la ADAM17 en las células germinales es fundamental en la apoptosis de estas células. Es por ello, se propuso la siguiente hipótesis: La presencia de ADAM17 es necesaria para la apoptosis de células germinales masculinas tanto fisiológica como inducida por los xenoestrógenos BFA y NF durante la espermatogénesis del ratón. En donde se plantearon 4 objetivos específicos: (1) Determinar la participación de la ADAM17 de las células germinales masculinas meióticas y post-meióticas sobre la apoptosis de estas células in vivo, (2) Evaluar la participación de la ADAM17 de las células germinales masculinas meióticas y postmeióticas sobre la apoptosis de estas células inducida por los xenoestrógenos BFA y NF in vivo, (3) Determinar el efecto de los xenoestrógenos BFA y NF sobre la actividad de la ADAM17 y (4) Estudiar in vitro la participación de la ADAM17 sobre la apoptosis inducida por BFA y NF en líneas celulares. Para esto, se creó un ratón knock out condicional para la ADAM17 en células germinales masculinas utilizando la tecnología Cre-LoxP. En estos ratones se observó que la apoptosis fisiológica e inducida por los xenoestrógenos BFA y NF disminuyó significativamente en relación a los silvestres cuando se evaluó el número de células caspasa-3 activa mediante inmunofluorescencia, el número de células picnóticas por tinción Pas-He, y el porcentaje de células TUNEL positivas. Usando estos ratones se estableció que la presencia de la ADAM17 es fundamental en la apoptosis de células germinales masculinas tanto en condiciones fisiológicas como inducida por BFA y NF. Además, se determinó la participación de esta metaloproteasa en el desarrollo de la espermatogénesis. Para ello, se calculó el porcentaje del peso testicular en comparación al peso corporal a los 21 y 60 días de edad, donde se observó una disminución significativa de este en ratones knock out respecto a los wild type. Esto puede ser explicado por la disminución en los parámetros histológicos del testículo, como la altura del epitelio, diámetro de los túbulos seminíferos y del lumen de los túbulos seminíferos observado en los ratones knock out respecto a los wild type. Por otro lado, para dilucidar si BFA y NF inducen actividad metaloproteasa de la ADAM17 (lo cual sería fundamental para la muerte de las células germinales) se creó un sistema in vitro en el cual se expresó una proteína que tiene el dominio intracelular, el de transmembrana y parte del dominio extracelular de 5 sustratos de la ADAM17 fueron fusionados con fosfatasa alcalina (FA). Estos sustratos son Neuregulina β1 (NRGβ1), Tumor Necrosis Factor α (TNFα), Heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF), Kit Ligand 2 (KitL2), o Transforming Growth Factor α (TGFα). Este sistema in vitro fue expresado en líneas celulares de células de Sertoli de ratón (TM4), en células de cáncer de próstata humana (LnCaP), o en células de fibroblasto de embrión de ratón (mEFs). De esta manera, se midió la liberación de fosfatasa alcalina al medio de cultivo (mediante la actividad de FA), lo que indirectamente refleja la actividad metaloproteasa de la ADAM17. Usando este sistema in vitro, se mostróque la inhibición farmacológica y/o genética (knockdown) de la ADAM17 previene la liberación de FA inducida por BFA o NF. Además, utilizando células mEFs que pierden iRhom1 y/o iRhom2 (proteínas inactivadas de la familia romboide) se determinó que la activación de ADAM17 inducida por BFA y NF depende de iRhom2 pero no de iRhom1. Por último, mediante los niveles proteicos del fragmento de 86 kDa de PARP (sustrato de caspasa-3) evaluados por western blot; el porcentaje de la población de células sub-G1 y de células Anexina V evaluadas por citometría de flujo se determinó que la inhibición genética de la ADAM17 previene la muerte celular inducida por BFA y NF. En conclusión la ADAM17 participa en la apoptosis de células germinales tanto fisiológica como inducida por los xenoestrógenos BFA y NF durante la espermatogénesis del ratón.
Aislamiento social juvenil y su impacto en la función del receptor del factor liberador de corticotropina del tipo 1 en el núcleo accumbens de ratas
(2023) Zegers Delgado, Juan Andrés; Gysling Caselli, Katia; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El aislamiento social es un modelo de estrés crónico ampliamente utilizado para estudiar el impacto neurobiológico de circunstancias adversas en etapas tempranas de la vida. Roedores expuestos a aislamiento social prolongado (más de 4 semanas) muestran un aumento en conductas tipo ansiosas y cambios significativos en la actividad de la dopamina (DA) en el Nucleus Accumbens (NAc) durante su etapa adulta. Pocos estudios han comparado el impacto del aislamiento social durante distintas etapas de la vida y por periodos de tiempo más acotados (menos de 4 semanas). A diferencia de animales juveniles, adultos expuestos a aislamiento por periodos acotados no muestran cambios en conductas tipo ansiosas, sugiriendo una ventana de vulnerabilidad durante la adolescencia. El sistema del factor de liberación de corticotropina (CRF) participa de la respuesta al estrés. El sistema CRF está compuesto por los ligandos peptídicos CRF y urocortina 1, 2 y 3. Y dos receptores CRF-R1 y CRF-R2, ambos metabotrópicos acoplados a proteína G. Resultados de nuestro laboratorio mostraron que el aislamiento social por 10 días de ratas jóvenes indujo un incremento en las conductas tipo ansiosas y un aumento de DA frente a un estímulo despolarizante en el NAc. Además, el rol de CRF-R1 inhibitorio sobre la DA y excitatorio sobre el glutamato se perdió después del aislamiento social. Estos resultados sugirieron que el aislamiento social de las ratas jóvenes modifica el nivel y funcionalidad de CRF-R1 en NAc. El objetivo de esta tesis fue determinar el impacto del aislamiento social juvenil en la función del CRF-R1 en el NAc de ratas. Nuestros resultados mostraron que el aislamiento social invierte el rol de CRF-R1 sobre los niveles de DA, pasando de ser inhibitorio a excitatorio. Además, se observó una pérdida del efecto de CRF-R1 sobre el glutamato. Por el contrario, el rol de CRF-R1 sobre GABA no se modificó, manteniendo un tono inhibitorio después del aislamiento. El estudio de las vías de señalización involucradas indicó que el efecto de CRF-R1 es mediado por Gi en terminales dopaminérgicos y Gs en terminales glutamatérgicos. La disminución de la actividad de la vía Gs en ratas aisladas revirtió los cambios neuroquímicos inducidos por aislamiento. El aislamiento no produjo cambios en la expresión de CRF-R1, pero, indujo cambios en los niveles de las distintas isoformas de CRF-R1. En conjunto, los datos muestran que el aislamiento social de ratas juveniles altera el rol de CRF-R1 sobre la neurotransmisión en el NAc lo que podría atribuirse a una diferencia en la hetero-dimerización de sus isoformas.
AMPA receptor stabilization mediated by non-canonical Wnt signaling protects against Aβ42 oligomers synaptotoxicity
(2018) Montecinos Oliva, Carla; Inestrosa Cantín, Nibaldo; Choquet, Daniel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Los receptores AMPA (AMPARs) son los principales responsables de la respuesta excitatoria rápida en el sistema nervioso central, incluyendo neuronas hipocampales, estudiadas en esta tesis. A diferencia de otros receptores glutamatérgicos, los AMPARs son altamente dinámicos. Dentro de las espinas dendríticas, se pueden mover hacia y desde compartimentos endocíticos y hacia la membrana plasmática. Una vez en la superficie, a través de difusión lateral, se pueden anclar a proteínas de la densidad postsináptica o regresar a compartimentos endocíticos. Por otro lado, los oligómeros Aβ (oAβ) aumentan la endocitosis de AMPARs, disminuyen la densidad de espinas dendríticas y causan una falla generalizada de la transmisión sináptica excitatoria. Estos efectos, entre otros, se engloban en el término “sinaptotoxicidad por oAβ” y es uno de los principales puntos de estudio en la etiología de la enfermedad de Alzheimer. Al contrario, Wnt5a un ligando endógeno conocido por activar la víano canónica en neuronas hipocampales, genera un aumento en corrientes excitatorias y en losclusters de PSD95 y protege a las neuronas contra la sinaptotoxicidad causada por oAβ. Debido a esto, procedimos a estudiar el mecanismo por el cual Wnt5a protege de la sinaptotoxicidad causada por Aβ. Esto nos llevó a evaluar los efectos de Wnt5a en uno de los principales factores en la transmisión glutamatérgica, la dinámica de los AMPARs. Con el uso de microscopía de super-resolución en neuronas hipocampales vivas, encontramos que Wnt5a modula la dinámica y localización de los AMPARs. Específicamente, Wnt5a estabiliza los AMPARs en espinas y dendritas. Lo cual se correlaciona con un aumento en la co-localización e interacción entre GluA2 y PSD95. Estos efectos son causados únicamente por la activación no-canónica de la vía Wnt, a través del ligando Wnt5a y no por los efectos canónicos de Wnt7a. De manera interesante, la pre-incubación de Wnt5a previene la toxicicidad de los oligómeros Aβ y mantiene la dinámica basal de los AMPARs. Esta data sugiere que Wnt5a promueve la estabilización de AMPARs, previniendo los efectos synaptotóxicos de los oAβ.
Análisis de los cambios tempranos del transcriptoma en respuesta al daño en la médula espinal de Xenopus laevis.
(2019) Peñailillo Lazo, Johany Freddy; Larraín Correa, Juan Agustín; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
A diferencia de los mamíferos, otros animales como las larvas de anfibios anuros (donde se incluye a Xenopus) pueden lograr una recuperación funcional completa después de una lesión en la médula espinal. En nuestro laboratorio, se ha establecido a la rana Xenopus laevis (X. laevis) como un organismo modelo para estudiar la regeneración de la médula espinal. Una de las principales ventajas de X. laevis es que las larvas en etapas 50-54 (estadios-R) pueden recuperarse anatómica, histológica y funcionalmente después de una lesión en la médula espinal (LME). Esas habilidades se pierden por completo en las ranas juveniles (estadio-NR). La zona ependimaria del canal central de la médula espinal de las larvas en estadios-R presenta un alto porcentaje de células progenitoras neuronales (NPC) Sox2+. Estas se activan rápidamente en respuesta a una lesión y son necesarias para lograr la regeneración completa de la médula espinal. Nuestro interés es identificar las redes genéticas y las vías de señalización involucradas en la activación temprana de NPC. Para identificar los mecanismos y las vías de señalización involucradas en la activación de células Sox2+, hemos realizado un análisis de los cambios del transcriptoma durante las primeras 21 horas posteriores a la transección (hpt) en animales en estadios-R. Con este objetivo, el tejido del sitio de la lesión se aisló cada 1 hora luego de la lesión en animales transectados, así como también en animales control, con daño simulado (sham) y sin daño. Como resultado de este muestreo y posterior secuenciación de ARNm conseguimos más de 100 librerías de RNA-seq, con las cuales se realizó un exhaustivo análisis bioinformático. Los genes expresados diferencialmente (GEDs) se identificaron mediante Procesos Gaussianos. Posteriormente, la estructura modular de los GEDs se infirió utilizando un Análisis de redes de Co-expresión Génica Ponderada (WGCNA). Estos módulos de co-expresión fueron analizados buscando procesos biológicos y vías de señalización KEGG enriquecidas. Además, analizamos los motivos de unión al ADN de factor de transcripción enriquecidos en el promotor proximal de genes coexpresados y las interacciones proteína-proteína entre los GEDs. Identificamos 1850 GEDs que se agruparon en 11 módulos de coexpresión (3 regulados negativamente, 2 regulados positivamente con una activación inmediata, 3 regulados positivamente con una activación intermedia y 3 regulados positivamente con una activación tardía). El análisis de ontología génica reportó: (1) un enriquecimiento de los reguladores negativos de la señalización mTOR en los primeros módulos regulados negativamente, (2) un aumento en factores de transcripción en los módulos de activación inmediata, (3) un aumento en los componentes de la biogénesis del ribosoma en módulos de activación intermedia y (4) un aumento en genes asociados a división de células progenitoras y de ciclo celular en módulos de activación tardía. En base a nuestros análisis bioinformáticos decidimos estudiar el rol de la vía mTOR durante las primeras horas luego de la transección. Análisis por Western Blot e Inmunofluorescencia contra p-S6, la forma activa de un componente intracelular de la vía mTOR, mostraron una activación rápida a las 3 hpt y principalmente en las células de la zona ependimaria del canal central cercanas al sitio de la lesión y los cuerpos neuronales a lo largo del sistema nervioso. La inhibición de esta vía de señalización utilizando rapamicina bloquea la proliferación de células Sox2+ y la recuperación funcional después de la LME. Estos resultados sugieren un papel clave para la vía mTOR en la rápida activación de las células Sox2+ para una adecuada recuperación después de la LME en renacuajos. De esta manera, podemos concluir que identificamos cambios tempranos en el transcriptoma de la médula espinal en respuesta al daño a la médula espinal, los cuales pueden ser asociados a varios procesos biológicos y vías de señalización que se despliegan en ondas transcripcionales secuenciales después de la LME. Finalmente, análisis bioinformáticos y pruebas funcionales de la vía mTOR sugieren que esta vía de señalización sería clave durante las primeras horas de la regeneración de la médula espinal.
ApoE4 reduces cortical embryonic neurogenesis
(2025) Gherardelli Brooks, Camila; Inestrosa Cantín, Nibaldo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La apolipoproteína E (ApoE) es una proteína que se une a lípidos y existe en tres isoformas principales: ApoE2, ApoE3 y ApoE4. Cada isoforma presenta características estructurales y funcionales distintas que modulan diferencialmente la función cerebral. Por ejemplo, el polimorfismo de ApoE es el mayor factor de riesgo genético para la enfermedad de Alzheimer de aparición tardía, y la presencia de ApoE4 aumenta significativamente el riesgo de desarrollar la enfermedad. Adicionalmente, ApoE4 se ha asociado con una reducción del grosor cortical, un deterioro acelerado de la memoria y una función cognitiva deficiente, mientras que ApoE2 parece ser protector, ya que se correlaciona con un mayor grosor cortical y una mayor resistencia neuronal en comparación con ApoE3. Aunque los efectos de ApoE suelen estudiarse en adultos y en relación con el envejecimiento, evidencia emergente sugiere que su influencia comienza temprano en la vida. De hecho, los bebés portadores de ApoE4 ya muestran alteraciones corticales, lo que indica que las isoformas de ApoE pueden moldear el desarrollo cerebral y establecer las bases para futuros resultados cognitivos. Para investigar estos efectos tempranos, generamos organoides cerebrales humanos para analizar el impacto de las isoformas de ApoE en la neurogénesis cortical. Nuestros hallazgos demuestran que los organoides que expresan ApoE4 exhiben neurogénesis prematura a expensas de la producción de progenitores neuronales, lo que reduce la generación de neuronas corticales. Por el contrario, los organoides con ApoE2 favorecen la generación de progenitores corticales, lo que resulta en un mayor número de neuronas corticales. El análisis de ARN de célula única y los estudios funcionales revelaron que ApoE4 induce amplios cambios en la expresión génica de los progenitores neuronales, con alteraciones significativas en vías asociadas al ciclo celular. Además, el análisis de cerebros post mortem de adultos jóvenes portadores de ApoE4 confirmó una reducción en el número de neuronas de las capas superiores de la corteza. En conjunto, nuestro estudio esclarece cómo ApoE altera la neurogénesis cortical durante el desarrollo cerebral, lo que podría aumentar la susceptibilidad al deterioro cognitivo en etapas posteriores de la vida.
Associations between habitat conditions, sociality, and brain organization in octodontid rodents.
(2014) Sobrero Inverardi, Raúl Eduardo; Ebensperger Pesce, Luis Alberto; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Nuestro conocimiento sobre la evolución del comportamiento social en roedores octodóntidos es aún fragmentario. La información disponible indica que las especies filogenéticamente basales son solitarias, mientras que las más derivadas tienden a ser sociales. Sin embargo, la información sobre la estructura social disponible para varias especies es anecdótica, lo cual dificulta el establecimiento de conclusiones robustas sobre la evolución del comportamiento social en este clado. Este es el primer estudio que cuantifica la actividad, uso del espacio, y comportamiento social del degú costino (Octodon lunatus), una especie derivada de octodóntido. Durante noviembre y diciembre de 2010 y 2011 se utilizaron métodos de captura-recaptura y telemetría para cuantificar el patrón diario de actividad superficial, ámbitos de hogar, solapamientos entre ámbitos de hogar, y uso compartido de parches de descanso y nidificación en una población costera localizada en el centro-norte de Chile.La actividad de O. lunatus, medida como desplazamientos individuales entre localizaciones consecutivas, mostró una tendencia estadísticamente no significativa a ser mayor en horas de la noche. Durante el día los animales usaron 1 a 3 sitios de descanso y anidamiento asociados con una alta cobertura arbustiva, donde Pouteria splendens (lúcumo) fue la especie dominante. Machos y hembras compartieron estos sitios de descanso en múltiples ocasiones. El solapamiento entre los ámbitos de hogar tendió a ser mayor en animales que además compartieron sitios de descanso comparado con animales que no compartieron estos sitios. En base al uso compartido de refugios se identificó 1 grupo social en 2010 y 4 grupos en 2011. La composición de estos grupos fue de 1 a 3 hembras adultas y de 1 a 2 machos adultos (2 a 4 adultos en total). Globalmente, los resultados indicaron que O. lunatus muestra algún grado de sociabilidad, observación que apoya una tendencia en la cual el comportamiento social es más frecuente en especies filogenéticamente derivadas de octodóntidos.
Astrocytes from the retrotrapezoid nucleus drives chemoreceptor neuron hyper-responsiveness to hypercapnia in heart failure: role of oxidative stress and glutamate spill-over
(2024) Díaz Jara, Esteban; Río Troncoso, Rodrigo Andre del; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La insuficiencia cardiaca con fracción de eyección preservada (ICFEP) es una enfermedad crónica caracterizada por una alta prevalencia de desórdenes respiratorios e irregularidades en el patrón ventilatorio, las cuales están estrechamente asociados con la potenciación del quimiorreflejo central. El principal núcleo quimiorreceptor central es el núcleo retrotrapezoide (RTN), ubicado en la superficie del tronco encefálico, que contiene neuronas que frente a un estímulo hipercápnico propagan potenciales de acción excitatorios hacia los centros respiratorios, modulando el patrón respiratorio. En modelos preclínicos de ICFEP, la eliminación selectiva de las neuronas quimiorreceptoras del RTN normaliza la quimiorrefleja central y elimina la irregularidad en el patrón respiratorio. Sin embargo, los mecanismos celulares que potencian la función del RTN durante la ICFEP no se han estudiado previamente. En los últimos años, se ha demostrado que, además de las neuronas quimiorreceptoras, los astrocitos ubicados en el RTN desempeñan un papel clave en la regulación de la quimiorrecepción en condiciones normales. Sin embargo, se desconoce el rol de estas células en el control de la quimiorecepción central durante la ICFEP. Por lo tanto, propuse como hipótesis que "El estrés oxidativo aumenta el impulso del quimioreflejo central en la ICFEP al reducir la captación de glutamato mediada por los astrocitos en el núcleo retrotrapezoide". Los objetivos principales de esta tesis doctoral fueron: i) Determinar los niveles de estrés oxidativo y glutamato en el RTN y estudiar la contribución del estrés oxidativo en las respuestas exageradas del quimiorreflejo central en ratas con ICFEP; ii) Determinar las alteraciones en la morfología de los astrocitos y la localización y expresión del transportador de glutamato-1 (GLT-1) en el RTN de ratas con ICFEP; iii) Determinar la actividad neuronal en secciones del tronco encefálico que contienen el RTN de ratas con ICFEP; y iv) Determinar si la sobre-expresión de GLT-1 en los astrocitos del RTN de ratas con ICFEP restaura la respuesta normal de las neuronas quimiorreceptoras a la hipercapnia. La ICFEP fue inducida en ratas Sprague Dawley machos adultos (~250 g) mediante una fístula arteriovenosa. Se utilizó pletismografía de cuerpo entero para evaluar tanto la respuesta ventilatoria a la hipercapnia (FiCO2 7%), como el patrón respiratorio en reposo. Los niveles del anión superóxido y de superóxido dismutasa 2 en el RTN se determinaron por tinción con dihidroetidio (DHE) y Western Blot, respectivamente. La morfología de los astrocitos y los niveles de GLT-1 en el RTN se determinaron mediante inmunofluorescencia y RNAscope, respectivamente. La localización celular de SOD2 y de GLT-1 se realizó mediante análisis bioinformáticos. Los niveles de glutamato extracelular en el RTN se midieron en animales anestesiados, y posteriormente mediante Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). Para evaluar la actividad de las neuronas quimiorreceptoras RTN, se realizaron inyecciones estereotáxicas de un adenovirus que permitió la expresión de un sensor de calcio citoplasmático (GCaMP6s) en las neuronas. Posteriormente se analizaron los cambios de fluorescencia en las secciones del tronco encefálico que contenían el RTN mediante microscopía confocal. Finalmente, la sobreexpresión de GLT-1 en astrocitos RTN fue realizada por la inyección estereotáxica de un adenovirus que permitió la expresión del transportador de glutamato-1 bajo el promotor específico de astrocitos, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Los animales con ICFEP presentaron un aumento en los niveles del anión superóxido en el RTN, los cuales están estrechamente relacionados con la potenciación del quimiorreflejo central en animales ICFEP. El aumento de los niveles de superóxido en el RTN se asoció con la disminución en los niveles de expresión de SOD2, tanto a nivel de mRNA y proteína, en los animales con ICFEP. En paralelo, animales con una disminución parcial de SOD2 presentan un aumento en los niveles de superóxido en el RTN los cuales se correlacionan con la potenciación del quimiorreflejo central, similar a lo observado en animales con ICFEP. Análisis de co-localización y bioinformáticos demostraron que SOD2 se expresa preferentemente en los astrocitos del RTN en lugar de en las neuronas quimiorreceptoras. Las ratas con ICFEP presentan un aumento en los niveles de glutamato extracelular en el RTN tanto en condiciones basales como durante el estímulo hipercápnico comparado con animales Sham. Tanto las ratas con ICFEP como en animales con una disminución parcial de SOD2 presentan una disminución en la morfología de los astrocitos del RTN. Interesantemente se observó que los animales con ICFEP presentan una disminución en la tinción de NMB, el marcador de neuronas quimiorreceptoras del RTN. Análisis de co-localización y bioinformáticos demostraron que GLT-1 se expresa preferentemente en los astrocitos del RTN y no en las neuronas quimiorreceptoras, y que en los animales con ICFEP, existe una disminución en los niveles de GLT-1 en el RTN. Las neuronas quimiorreceptoras del RTN de animales con ICFEP presentan un aumento de actividad tanto en condiciones basales como al ser expuestas a un medio ácido. Finalmente, la sobre-expresión de GLT-1 en los astrocitos del RTN de animales con ICFEP normaliza la actividad de las neuronas quimiorreceptoras del RTN. Además, la sobreexpresión de GLT-1 normaliza los niveles extracelulares de glutamato en el RTN, el quimiorreflejo central y el patrón respiratorio en animales con ICFEP. Estos resultados sugieren que el aumento del estrés oxidativo y la disfunción de los astrocitos en el RTN juegan un rol clave en la potenciación del quimiorreflejo y en la progresión de la ICFEP, principalmente a través la recaptación del glutamato extracelular.
Aumento de proliferación y neurogénesis en la médula espinal de Xenopus laevis en respuesta a la sobre expresión de Lin28
(2022) Herrera Rojas, Mauricio Alejandro; Larraín Correa, Juan Agustín; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
En humanos un daño a la médula espinal se considera irreversible, sin embargo, existen animales con alta capacidad regenerativa tales como el pez cebra, el ajolote y la rana Xenopus laevis los cuales son capaces de regenerar la médula espinal después de un daño, recuperando las conexiones y movilidad perdida producto de la lesión. Para el estudio de la regeneración de la médula espinal, Xenopus laevis presenta ventajas que lo hacen un modelo único de estudio. En etapas pre-metamórficas es un animal con la capacidad de regenerar la médula, mientras que durante y después de la metamorfosis, este animal pierde esas capacidades, por lo que se transforma en un animal no regenerativo. Estudios de nuestro laboratorio utilizando a Xenopus laevissugieren que, para que ocurra regeneración de la médula espinal en estadios regenerativos, es necesario la activación de progenitores neurales identificados como células Sox2+. Al analizar los niveles de expresión de Sox2, se ha visto que estos disminuyen a medida que la rana avanza el desarrollo (metamorfosis). Por lo tanto, se determinó que la disminución de Sox2, podría ser una causa del porqué la rana pierde las capacidades regenerativas en estadios pre-metamórficos. La pregunta que surge en cuestión es ¿existe algún factor que pueda regular a los progenitores neurales Sox2+ y promover la neurogénesis para la regeneración de la médula espinal? Cimadamore en el 2013 demostró que la sobre expresión exógena de la proteína de unión a RNA Lin28 era suficiente para rescatar a los progenitores neuronales de un defecto proliferativo en los estadios más tempranos de la neurogénesis, asociados a la pérdida de Sox2. En el mismo año, el grupo de Shyh-Chang demostró que se mejoraba la regeneración acelerando el recrecimiento de cartílagos, huesos y tejido mesenquimal después de la amputación de los dígitos distales o la perforación de las orejas en los animales. Por último, una expresión constitutiva de Lin28 en células P19, causó un bloqueo completo de glicogénesis acompañado de un incremento en la neurogénesis. Estos antecedentes nos hacen pensar Lin28 podría ser un factor preponderante para inducir la regeneración en la médula espinal mediante la regulación de los progenitores neurales Sox2+. En base a esto, nosotros presentamos la siguiente hipótesis: La sobre expresión de Lin28 produce un aumento de proliferación celular y de la neurogénesis en la médula espinal de Xenopus laevis. Nuestros resultados muestran que hay un aumento significativo de la proliferación de progenitores Sox2 en la médula espinal de la rana producto del daño y que a través de los métodos clásicos de estudio de la neurogénesis con la utilización de un marcador de neurona madura NeuN, se observó que existe neurogénesis en respuesta al daño en estadios regenerativos de Xenopus laevis, por lo tanto, la neurogénesis podría ser un posible mecanismo por el cual la rana puede regenerar la médula espinal después de una daño. Además, los ensayos de sobre expresión de Lin28a en estadios regenerativos demostraron que esta proteína de unión a RNA, regularía la proliferación celular aumentando la actividad de las células progenitoras e induciría la diferenciación celular hacia un fenotipo neuronal generando un aumento en la neurogénesis en la médula espinal en ausencia de daño. Por lo tanto, nosotros creemos Lin28a sería un buen candidato de estudio para la regeneración de la médula espinal de Xenopus laevis a través del aumento de la neurogénesis.
B3 transcription factors regulate iron distribution in A. thaliana embryos
(2021) Grant Grant, Susana Margarita; Roschzttardtz Choucroun, Hannetz France; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El hierro es un macronutriente esencial para todos los seres vivos. En humanos, la deficiencia de hierro en la dieta es la principal causa de anemia en el mundo. La Organización Mundial de la Salud a propuesto la biofortificación de cultivos como una alternativa para aumenta el contenido de hierro en los alimentos. Uno de los cultivos más consumidos en la dieta humana son las semillas. Sin embargo, poco se conoce sobre la acumulación del hierro en semillas. En Arabidopsis thaliana durante la maduración del embrión el hierro se acumula en las vacuolas de la capa celular que rodea la provasculatura. En A. thaliana y otras plantas modelo se han identificado tres factores de transcripción B3, FUS3 (FUSCA3), LEC2 (LEAFY COTYLEDON2) y ABI3 (ABSCISIC ACID INSENSITIVE 3), que cumplen una función crítica en la acumulación de compuestos de almacenaje como proteínas y lípidos en la semilla durante la maduración. La función de los factores de transcripción B3 en la maduración y la acumulación de compuestos de almacenaje ha sido bien estudiaba, sin embargo, la función de estos factores de transcripción B3 en la acumulación de micronutrientes como el hierro no ha sido estudiada. En este trabajo se estudió el rol de los factores de transcripción B3 en la homeostasis de hierro en semillas de A. thaliana, utilizando mutantes para los factores de transcripción B3 y técnicas histológicas y de biología molecular. En este trabajo se determinó que los factores de transcripción B3 participan en la regulación de la distribución de hierro en semillas de A. thaliana, pero no así el contenido total de hierro en semilla. Los resultados de este trabajo mostraron que los genes asociados a la homeostasis de hierro cambiaron su expresión en las semillas mutantes para los factores de transcripción B3. Este cambio en la expresión coincide con el fenotipo heterocrónico de las semillas mutantes en los genes de los factores de transcripción B3. Finalmente, a través de una Red de Regulación Génica se encontró un nuevo rol para la vía de respuesta a etileno asociado a la distribución de hierro en semillas. Estos resultados entregan algunas respuestas sobre la regulación de la homeostasis de hierro en semillas, a pesar de que aún quedan muchas preguntas sin respuesta, como, por ejemplo: ¿Cómo el etileno regularía la distribución de hierro en semillas? y ¿Qué factores de transcripción regulan directamente a los genes asociados a la homeostasis de hierro?
BZIP transcription factors and transcriptional regulatory networks in the neurospora circadian system
(2014) Montenegro Montero, Alejandro Esteban; Larrondo Castro, Luis Fernando; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Circadian clocks are endogenous cellular timekeepers that confer daily rhythms to a large number of biological processes. These clocks are present in various organisms across different evolutionary lineages, in which they regulate close to 24-hours rhythms in gene expression, physiology and behavior, enabling individuals to anticipate predictable environmental variations. The ascomycete Neurospora crassa has played a key role in the unveiling of the molecular and genetic basis of these time-telling machineries. In Neurospora, as in other eukaryotes, the integration of a series of cellular and molecular processes gives rise to a robust cell-based pacemaker, capable of coordinating rhythmic control of several aspects of their biology. Although a detailed molecular description of the core oscillator or pacemaker is now possible in model eukaryotes, there is limited information on the mechanisms that allow it to regulate rhythmic processes. Such “output pathways”, the circuits through which the pacemaker endows different processes with rhythmicity, are the least characterized aspect of circadian systems. In Neurospora, a hierarchical arrangement of transcriptional regulators has been proposed as the main mechanism through which the clock regulates rhythmic gene expression.The different actors involved in such time relay, connecting the oscillator with overt rhythms, are however largely unknown. In addition, despite decades as a research model organism, little is known about transcriptional regulatory networks in this fungus and the vast majority of transcription factors in Neurospora remain uncharacterized. In an effort to improve current knowledge of output pathways, the most neglected aspect of circadian biology, in a clock model system and study transcriptional regulatory networks in a model eukaryote, we set out to characterize the bZIP family of transcriptional regulators in Neurospora, in the context of its circadian system. We report a complete revision of the list of sequence-specific DNA-binding proteins in this fungus, which resulted in the identification of several novel ones, including many bZIP proteins. As the few transcription factors that have been associated with output pathways in Neurospora have been shown to exhibit clock input, we evaluated whether the expression of bZIP encoding genes in this organism is under control of the circadian clock. By using a luciferase-based, high-throughput screening system, we identified several bZIP encoding genes whose expression is regulated by the circadian pacemaker. A major limitation in the study of transcriptional regulatory networks in Neurospora, such as those underlying clock regulated transcription, stems from the fact that little is known about the sequence preference of its transcription factors. With the goal of identifying and characterizing transcriptional regulatory networks in which the putative Neurospora transcription factors participate, we employed double-stranded DNA microarrays known as protein-binding microarrays, to determine the sequence preference of Neurospora transcription factors.Such an approach allows for rapid, high-throughput and unbiased characterization of the sequence specificity of DNA-binding proteins. This resulted in the determination of the sequence preference of over half of Neurospora predicted transcription factors, information that together with the various molecular tools available in Neurospora, led to the identification of a rhythmically expressed bZIP transcription factor, ADA-1, as a regulator of output pathways in Neurospora, controlling various output genes. In addition, this information allowed for the evaluation of the role of another bZIP transcription factor, ASL-1, in such pathways. Notably, this is the first report aimed at studying DNA-binding specificities on a global scale in the fungal kingdom outside of the yeast clade, representing a powerful resource for the study of transcriptional regulatory networks in filamentous fungi, the largest group within the fungal kingdom. Indeed, through the use of these data we identified, for the first time, a transcription factor that is required for growth under osmotic stress in Neurospora. Lastly, we report on the identification of a novel process involved in output pathways in Neurospora, namely cell fusion pathways, and we herein show it to be necessary for proper rhythms in a number of genes, including bZIP encoding genes. As a whole, the work reported in this Thesis, represents a major advancement in the study of bZIP proteins and transcriptional regulatory networks in Neurospora.
C-ABL estabiliza los niveles de HDAC2 por fosforilación en tirosina reprimiendo la expresión de genes neuronales en la enfermedad de Alzheimer.
(2014) González Zúñiga, Marcelo Andrés; Álvarez Rojas, Alejandra; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La Enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo caracterizado por un deterioro cognitivo progresivo. El sello distintivo de los cerebros afectados con la enfermedad de Alzheimer es la presencia de agregados proteicos insolubles. En este sentido, la hipótesis de la cascada del amiloide plantea que la acumulación y agregación del péptido A\03B2 desencadena un conjunto de mecanismos que conducen a la disfunción y la apoptosis de las neuronas. Entre los mecanismos descritos, uno que ha despertado gran interés es la disminución en la expresión de genes neuronales producto del incremento en los niveles de HDAC2. Esta enzima cataliza la deacetilación de las histonas, lo que provoca que la cromatina adquiera una conformación cerrada que es transcripcionalmente inactiva. Actualmente, la evidencia indica que HDAC2 esta involucrada en el deterioro cognitivo y en la disfunción sináptica que caracteriza a la EA. A pesar de que se ha descrito extensamente que el incremento en los niveles de HDAC2 tiene un papel negativo en el desarrollo de la EA, los mecanismos moleculares involucrados en este incremento no están completamente dilucidados. Interesantemente, se ha demostrado en modelos in vitro que la tirosina quinasa c-Abl esta implicada en la represión de genes por un mecanismo epigenético, el cual sería dependiente de la actividad de las HDACs. En neuronas, la tirosina quinasa c-Abl es un actor clave en los procesos neurodegenerativos. En efecto, resultados de nuestro laboratorio han demostrado que la c-Abl es activada y participa en la muerte neuronal, la disfunción y la pérdida sináptica en modelos de la EA.
Caracterización de la regulación transcripcional y función del gen SDH2-3 de Arabidopsis thaliana.
(2013) Restovic Carvajal, Franko; Jordana, Xavier; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Our group has undertaken the study of mitochondrial function in plants focusing on complex II (succinate dehydrogenase, SDH) of Arabidopsis thaliana. This complex plays a pivotal role in the tricarboxylic acid (TCA) cycle and the electron transport chain, two fundamental processes in the energetic plant metabolism. We have described the existence of three nuclear genes coding for iron-sulfur proteins (SDH2), named SDH2-1, SDH2-2 and SDH2-3. Two of them, SDH2-1 and SDH2-2, are almost identical (96%) and share the same exon-intron structure. SDH2-3 on the other hand, has a different exonintron structure and has approximately 70% identity to the other two. Additionally, unlike SDH2-1 and SDH2-2 that are expressed in adult plants, SDH2-3 expression is confined to seed maturation and it decreases during germination, while SDH2-1 and SDH2-2 transcripts are low in seeds and they begin to accumulate after germination and during vegetative growth. We have described seed-specific cis-elements necessary for promoter activity (three ABA-responsive elements or ABRE and one RY element) and determined in vitro binding of seed-specific transcription factors to them (bZIP10, bZIP25 and bZIP53 binding to ABREs; ABI3 and FUS3 binding to RY). Moreover, we have determined that ABI3 and FUS3 are necessary for promoter activity in planta, as mutant lines of these factors showed decreased SDH2-3 levels in seeds. On the other hand, we have determined that SDH2-3 is important for seed germination, indicating a specific role during this developmental stage. The main focus of this thesis work is to study the seed-specific expression and the function of SDH2-3. It is worth noting that no reports of mitochondrial proteins bearing this singular expression pattern have been published. Therefore, we will determine essential regions of the SDH2-3 promoter and additional putative cis-elements controlling transcriptional regulation, transcription factors involved, and the function of this protein during seed maturation and postgerminative growth. Regarding the SDH2-3 promoter, during this thesis we were able to determine a minimal region necessary and sufficient for promoter activity, between -114 and +49 from the transcription start site. Moreover, the 5´UTR region (+1 to +49) is essential for SDH2-3 promoter activity, as determined by loss-of-function experiments. In addition, transient expression assays showed that ABI3 is able to activate SDH2- 3 transcription in vivo alone or in combination with bZIP factors bZIP10, bZIP25 or bZIP53. However, single bZIP factors were unable to activate the promoter, and only transfection with bZIP10 and bZIP53 was able to induce expression. Moreover, SDH2-3 transcript levels are significantly reduced in bzip53 mutant dry seeds. These results indicate the SDH2-3 promoter is activated by bZIP transcription factors and corroborate the importance of ABI3. On the other hand, we determined that SDH2-3 influences seed development and maturation, as lack of this protein resulted in decreased seed weight. Interestingly, protein content also showed a reduction in sdh2-3 mutants while lipid content did not show any biologically significant variation. This is an interesting feature since seed metabolism is directed during maturation towards the formation of seed proteins and lipids. Thus, the decrease in protein content would explain the lower total weight. Although it has been suggested that mitochondria plays a minor role during seed maturation, these results suggest that its role should be reconsidered, as it may carry out important metabolic tasks during this stage. Mitochondrial role during postgerminative growth is well characterized. Here we show that sdh2-3 mutants have impaired hypocotyl growth in the dark. Moreover, TTFA treatment (complex II inhibitor) abolishes hypocotyl growth and seedling establishment. All these results suggest an essential role for complex II during postgerminative growth and establishment. Wild seeds in nature generally germinate underground, in conditions where they lack direct sunlight. A seed with a non-functional SDH2-3 would be in disadvantage over wild-type seeds, which would elongate their hypocotyls further until they reach light in order to promote photoautotrophic growth. SDH2-3 gives an important advantage to the plant in energy-consuming processes such as germination and early stages towards seedling establishment. This work shows the importance that this nonessential gene can have in critical stages of plant development. The existence of a SDH2-3-like gene in the moss Physcomitrella patens has drawn our attention because SDH2-3 has been described as a seed-specific expressed gene in angiosperms, and mosses do not have seeds. We confirmed the SDH2-3-like gene is expressed and increases under osmotic stress, in contrast to saline stress, desiccation and high ABA content. Moreover, we determined that Physcomitrella SDH2-3 promoter lacks significant activity in Arabidopsis, either in seeds or vegetative tissue. These results indicate that the transcriptional regulation of this gene in Physcomitrella evolved in an independent way as compared to Arabidopsis.
Characterization of bacterial heme oxygenase ChuS of probiotic strain E. coli Nissle 1917 and its potential therapeutic uses.
(2020) Coronado Arrázola, Irenice; Bueno Ramírez, Susan; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La Hemoxigenasa (HO) es una enzima que cataliza el metabolismo del grupo hemo. Los productos derivados de la reacción son biliverdina (Bv), monóxido de carbono (CO) y hierro (Fe++). Varias propiedades han sido descritas para esta enzima, tales como antioxidante, anti-proliferativa, anti-apoptótica y anti-inflamatoria. La mayoría de ellas están relacionadas con la producción de CO, el cual es capaz de atenuar la respuesta inmune mediante la reducción de la inmunogenicidad de las células dendríticas y la modulación de las poblaciones de células T. Esta enzima se asoció inicialmente con células de mamíferos, especialmente humanos (HO-1), pero algunos estudios han identificado hemoxigenasas bacterianas. Algunas cepas de E. coli tienen el gen chuS que codifica para una HO bacteriana llamada ChuS, que está localizada en un operón que regula la captación y absorción del grupo hemo, con la subsecuente producción de CO. Por otro lado, últimamente la influencia de la microbiota en la regulación del sistema inmune ha alcanzado mucha importancia, dada su capacidad de modular directa e indirectamente la función de las células inmunes. Es más, como parte de la microbiota, los probióticos tienen un rol clave promoviendo ambientes antiinflamatorios, actuando en contra los patógenos, modulando la función de barrera, incluso mejorando enfermedades autoinmunes. En ese sentido, E. coli Nissle 1917 (EcN) es un probiótico comercial ampliamente utilizado, originalmente enfocado al tratamiento de la inflamación intestinal. De manera interesante, el gen chuS está presente en el genoma de esta bacteria. El propósito de este proyecto es evaluar si las propiedades anti-inflamatorias de la cepa probiótica EcN están dadas por la presencia de la hemoxigenasa bacteriana (ChuS) producida por esta bacteria. Para esto, desarrollamos una cepa mutante que carece de gen chuS. La primera parte del proyecto está dirigida a evaluar ambas cepas (WT y la mutante) en cultivos in vitro de DC y macrófagos, con diferentes MOI de la bacteria. Los resultados de la primera parte evidenciaron que ambas cepas son capaces de activar e inducir la maduración de DC y macrófagos, a pesar de la mutación de una de las cepas. LA segunda parte del proyecto estuvo enfocada en evaluar el rol de ChuS in vivo. Para esto, tratamos a ratones con ambas cepas probióticas. El primer ensayo evaluó la dosis más alta tolerada por ratones, que fue 1*109 CFU. Después del tratamiento con probióticos, se practicó eutanasia a un grupo de ratones, los resultados mostraron que la población de células T en el hígado disminuyó en los ratones tratados con la cepa mutante. A continuación, los ratones fueron infectados con Salmonella entérica serovar Enteritidis (SEN) para evaluar si el tratamiento pudiese afectar de alguna manera el resultado de la infección. Después de 48 h de infección, se practicó eutanasia a todos los ratones. De manera interesante, encontramos carga bacteriana en bazo, hígado, y nódulos linfáticos mesentéricos (MLN), en los ratones que fueron tratados con la cepa probiótica mutante y luego infectados con SEN. Además, entre los ratones tratados con la cepa mutante y la cepa WT, se observaron diferencias en la población de células T. También, la población de células B en MLN fue mayor en ratones tratados con la cepa mutante. Adicionalmente, 4 diferentes dosis fueron evaluadas para cada cepa (1*104, 1*105, 1*106, y 1*107 CFU). Este ensayo nos permitió evaluar las diferencias ente las cepas en cuanto a los patrones de inflamación y el perfil de citoquinas Es así que los ratones de los grupos tratados con la cepa mutante, sin importar la dosis, presentaron inflamación en los cortes histológicos de colon, moco en las heces o heces suaves. Además, la producción de IL-10, medida en sangre, fue mucho mayor para los ratones tratados con la cepa probiótica WT, que para los ratones tratados con la cepa mutante. También, la producción de IL-12p70 se mantuvo baja para los grupos tratados con las dosis más bajas y fue incrementando para las dosis mayores, en los ratones tratados con la cepa probiótica WT. En el caso de los ratones tratados con la cepa mutante, los niveles de IL-12p70 fueron siempre menores a los de IL-10. En conjunto, los resultados nos permiten sugerir que ChuS aparentemente tiene la habilidad de modular las propiedades inmunomoduladoras de EcN in vitro e in vivo. Lo cual es similar al comportamiento de HO-1, modulando el perfil de IL-10 e IL-12p70. Además, el efecto de EcN y ChuS no es solamente local, si no también sistémico, porque fue posible detectar diferencias en bazo, hígado, MLN y sangre.La Hemoxigenasa (HO) es una enzima que cataliza el metabolismo del grupo hemo. Los productos derivados de la reacción son biliverdina (Bv), monóxido de carbono (CO) y hierro (Fe++). Varias propiedades han sido descritas para esta enzima, tales como antioxidante, anti-proliferativa, anti-apoptótica y anti-inflamatoria. La mayoría de ellas están relacionadas con la producción de CO, el cual es capaz de atenuar la respuesta inmune mediante la reducción de la inmunogenicidad de las células dendríticas y la modulación de las poblaciones de células T. Esta enzima se asoció inicialmente con células de mamíferos, especialmente humanos (HO-1), pero algunos estudios han identificado hemoxigenasas bacterianas. Algunas cepas de E. coli tienen el gen chuS que codifica para una HO bacteriana llamada ChuS, que está localizada en un operón que regula la captación y absorción del grupo hemo, con la subsecuente producción de CO. Por otro lado, últimamente la influencia de la microbiota en la regulación del sistema inmune ha alcanzado mucha importancia, dada su capacidad de modular directa e indirectamente la función de las células inmunes. Es más, como parte de la microbiota, los probióticos tienen un rol clave promoviendo ambientes antiinflamatorios, actuando en contra los patógenos, modulando la función de barrera, incluso mejorando enfermedades autoinmunes. En ese sentido, E. coli Nissle 1917 (EcN) es un probiótico comercial ampliamente utilizado, originalmente enfocado al tratamiento de la inflamación intestinal. De manera interesante, el gen chuS está presente en el genoma de esta bacteria. El propósito de este proyecto es evaluar si las propiedades anti-inflamatorias de la cepa probiótica EcN están dadas por la presencia de la hemoxigenasa bacteriana (ChuS) producida por esta bacteria. Para esto, desarrollamos una cepa mutante que carece de gen chuS. La primera parte del proyecto está dirigida a evaluar ambas cepas (WT y la mutante) en cultivos in vitro de DC y macrófagos, con diferentes MOI de la bacteria. Los resultados de la primera parte evidenciaron que ambas cepas son capaces de activar e inducir la maduración de DC y macrófagos, a pesar de la mutación de una de las cepas. LA segunda parte del proyecto estuvo enfocada en evaluar el rol de ChuS in vivo. Para esto, tratamos a ratones con ambas cepas probióticas. El primer ensayo evaluó la dosis más alta tolerada por ratones, que fue 1*109 CFU. Después del tratamiento con probióticos, se practicó eutanasia a un grupo de ratones, los resultados mostraron que la población de células T en el hígado disminuyó en los ratones tratados con la cepa mutante. A continuación, los ratones fueron infectados con Salmonella entérica serovar Enteritidis (SEN) para evaluar si el tratamiento pudiese afectar de alguna manera el resultado de la infección. Después de 48 h de infección, se practicó eutanasia a todos los ratones. De manera interesante, encontramos carga bacteriana en bazo, hígado, y nódulos linfáticos mesentéricos (MLN), en los ratones que fueron tratados con la cepa probiótica mutante y luego infectados con SEN. Además, entre los ratones tratados con la cepa mutante y la cepa WT, se observaron diferencias en la población de células T. También, la población de células B en MLN fue mayor en ratones tratados con la cepa mutante. Adicionalmente, 4 diferentes dosis fueron evaluadas para cada cepa (1*104, 1*105, 1*106, y 1*107 CFU). Este ensayo nos permitió evaluar las diferencias ente las cepas en cuanto a los patrones de inflamación y el perfil de citoquinas Es así que los ratones de los grupos tratados con la cepa mutante, sin importar la dosis, presentaron inflamación en los cortes histológicos de colon, moco en las heces o heces suaves. Además, la producción de IL-10, medida en sangre, fue mucho mayor para los ratones tratados con la cepa probiótica WT, que para los ratones tratados con la cepa mutante. También, la producción de IL-12p70 se mantuvo baja para los grupos tratados con las dosis más bajas y fue incrementando para las dosis mayores, en los ratones tratados con la cepa probiótica WT. En el caso de los ratones tratados con la cepa mutante, los niveles de IL-12p70 fueron siempre menores a los de IL-10. En conjunto, los resultados nos permiten sugerir que ChuS aparentemente tiene la habilidad de modular las propiedades inmunomoduladoras de EcN in vitro e in vivo. Lo cual es similar al comportamiento de HO-1, modulando el perfil de IL-10 e IL-12p70. Además, el efecto de EcN y ChuS no es solamente local, si no también sistémico, porque fue posible detectar diferencias en bazo, hígado, MLN y sangre.La Hemoxigenasa (HO) es una enzima que cataliza el metabolismo del grupo hemo. Los productos derivados de la reacción son biliverdina (Bv), monóxido de carbono (CO) y hierro (Fe++). Varias propiedades han sido descritas para esta enzima, tales como antioxidante, anti-proliferativa, anti-apoptótica y anti-inflamatoria. La mayoría de ellas están relacionadas con la producción de CO, el cual es capaz de atenuar la respuesta inmune mediante la reducción de la inmunogenicidad de las células dendríticas y la modulación de las poblaciones de células T. Esta enzima se asoció inicialmente con células de mamíferos, especialmente humanos (HO-1), pero algunos estudios han identificado hemoxigenasas bacterianas. Algunas cepas de E. coli tienen el gen chuS que codifica para una HO bacteriana llamada ChuS, que está localizada en un operón que regula la captación y absorción del grupo hemo, con la subsecuente producción de CO. Por otro lado, últimamente la influencia de la microbiota en la regulación del sistema inmune ha alcanzado mucha importancia, dada su capacidad de modular directa e indirectamente la función de las células inmunes. Es más, como parte de la microbiota, los probióticos tienen un rol clave promoviendo ambientes antiinflamatorios, actuando en contra los patógenos, modulando la función de barrera, incluso mejorando enfermedades autoinmunes. En ese sentido, E. coli Nissle 1917 (EcN) es un probiótico comercial ampliamente utilizado, originalmente enfocado al tratamiento de la inflamación intestinal. De manera interesante, el gen chuS está presente en el genoma de esta bacteria. El propósito de este proyecto es evaluar si las propiedades anti-inflamatorias de la cepa probiótica EcN están dadas por la presencia de la hemoxigenasa bacteriana (ChuS) producida por esta bacteria. Para esto, desarrollamos una cepa mutante que carece de gen chuS. La primera parte del proyecto está dirigida a evaluar ambas cepas (WT y la mutante) en cultivos in vitro de DC y macrófagos, con diferentes MOI de la bacteria. Los resultados de la primera parte evidenciaron que ambas cepas son capaces de activar e inducir la maduración de DC y macrófagos, a pesar de la mutación de una de las cepas. LA segunda parte del proyecto estuvo enfocada en evaluar el rol de ChuS in vivo. Para esto, tratamos a ratones con ambas cepas probióticas. El primer ensayo evaluó la dosis más alta tolerada por ratones, que fue 1*109 CFU. Después del tratamiento con probióticos, se practicó eutanasia a un grupo de ratones, los resultados mostraron que la población de células T en el hígado disminuyó en los ratones tratados con la cepa mutante. A continuación, los ratones fueron infectados con Salmonella entérica serovar Enteritidis (SEN) para evaluar si el tratamiento pudiese afectar de alguna manera el resultado de la infección. Después de 48 h de infección, se practicó eutanasia a todos los ratones. De manera interesante, encontramos carga bacteriana en bazo, hígado, y nódulos linfáticos mesentéricos (MLN), en los ratones que fueron tratados con la cepa probiótica mutante y luego infectados con SEN. Además, entre los ratones tratados con la cepa mutante y la cepa WT, se observaron diferencias en la población de células T. También, la población de células B en MLN fue mayor en ratones tratados con la cepa mutante. Adicionalmente, 4 diferentes dosis fueron evaluadas para cada cepa (1*104, 1*105, 1*106, y 1*107 CFU). Este ensayo nos permitió evaluar las diferencias ente las cepas en cuanto a los patrones de inflamación y el perfil de citoquinas Es así que los ratones de los grupos tratados con la cepa mutante, sin importar la dosis, presentaron inflamación en los cortes histológicos de colon, moco en las heces o heces suaves. Además, la producción de IL-10, medida en sangre, fue mucho mayor para los ratones tratados con la cepa probiótica WT, que para los ratones tratados con la cepa mutante. También, la producción de IL-12p70 se mantuvo baja para los grupos tratados con las dosis más bajas y fue incrementando para las dosis mayores, en los ratones tratados con la cepa probiótica WT. En el caso de los ratones tratados con la cepa mutante, los niveles de IL-12p70 fueron siempre menores a los de IL-10. En conjunto, los resultados nos permiten sugerir que ChuS aparentemente tiene la habilidad de modular las propiedades inmunomoduladoras de EcN in vitro e in vivo. Lo cual es similar al comportamiento de HO-1, modulando el perfil de IL-10 e IL-12p70. Además, el efecto de EcN y ChuS no es solamente local, si no también sistémico, porque fue posible detectar diferencias en bazo, hígado, MLN y sangre.La Hemoxigenasa (HO) es una enzima que cataliza el metabolismo del grupo hemo. Los productos derivados de la reacción son biliverdina (Bv), monóxido de carbono (CO) y hierro (Fe++). Varias propiedades han sido descritas para esta enzima, tales como antioxidante, anti-proliferativa, anti-apoptótica y anti-inflamatoria. La mayoría de ellas están relacionadas con la producción de CO, el cual es capaz de atenuar la respuesta inmune mediante la reducción de la inmunogenicidad de las células dendríticas y la modulación de las poblaciones de células T. Esta enzima se asoció inicialmente con células de mamíferos, especialmente humanos (HO-1), pero algunos estudios han identificado hemoxigenasas bacterianas. Algunas cepas de E. coli tienen el gen chuS que codifica para una HO bacteriana llamada ChuS, que está localizada en un operón que regula la captación y absorción del grupo hemo, con la subsecuente producción de CO. Por otro lado, últimamente la influencia de la microbiota en la regulación del sistema inmune ha alcanzado mucha importancia, dada su capacidad de modular directa e indirectamente la función de las células inmunes. Es más, como parte de la microbiota, los probióticos tienen un rol clave promoviendo ambientes antiinflamatorios, actuando en contra los patógenos, modulando la función de barrera, incluso mejorando enfermedades autoinmunes. En ese sentido, E. coli Nissle 1917 (EcN) es un probiótico comercial ampliamente utilizado, originalmente enfocado al tratamiento de la inflamación intestinal. De manera interesante, el gen chuS está presente en el genoma de esta bacteria. El propósito de este proyecto es evaluar si las propiedades anti-inflamatorias de la cepa probiótica EcN están dadas por la presencia de la hemoxigenasa bacteriana (ChuS) producida por esta bacteria. Para esto, desarrollamos una cepa mutante que carece de gen chuS. La primera parte del proyecto está dirigida a evaluar ambas cepas (WT y la mutante) en cultivos in vitro de DC y macrófagos, con diferentes MOI de la bacteria. Los resultados de la primera parte evidenciaron que ambas cepas son capaces de activar e inducir la maduración de DC y macrófagos, a pesar de la mutación de una de las cepas. LA segunda parte del proyecto estuvo enfocada en evaluar el rol de ChuS in vivo. Para esto, tratamos a ratones con ambas cepas probióticas. El primer ensayo evaluó la dosis más alta tolerada por ratones, que fue 1*109 CFU. Después del tratamiento con probióticos, se practicó eutanasia a un grupo de ratones, los resultados mostraron que la población de células T en el hígado disminuyó en los ratones tratados con la cepa mutante. A continuación, los ratones fueron infectados con Salmonella entérica serovar Enteritidis (SEN) para evaluar si el tratamiento pudiese afectar de alguna manera el resultado de la infección. Después de 48 h de infección, se practicó eutanasia a todos los ratones. De manera interesante, encontramos carga bacteriana en bazo, hígado, y nódulos linfáticos mesentéricos (MLN), en los ratones que fueron tratados con la cepa probiótica mutante y luego infectados con SEN. Además, entre los ratones tratados con la cepa mutante y la cepa WT, se observaron diferencias en la población de células T. También, la población de células B en MLN fue mayor en ratones tratados con la cepa mutante. Adicionalmente, 4 diferentes dosis fueron evaluadas para cada cepa (1*104, 1*105, 1*106, y 1*107 CFU). Este ensayo nos permitió evaluar las diferencias ente las cepas en cuanto a los patrones de inflamación y el perfil de citoquinas Es así que los ratones de los grupos tratados con la cepa mutante, sin importar la dosis, presentaron inflamación en los cortes histológicos de colon, moco en las heces o heces suaves. Además, la producción de IL-10, medida en sangre, fue mucho mayor para los ratones tratados con la cepa probiótica WT, que para los ratones tratados con la cepa mutante. También, la producción de IL-12p70 se mantuvo baja para los grupos tratados con las dosis más bajas y fue incrementando para las dosis mayores, en los ratones tratados con la cepa probiótica WT. En el caso de los ratones tratados con la cepa mutante, los niveles de IL-12p70 fueron siempre menores a los de IL-10. En conjunto, los resultados nos permiten sugerir que ChuS aparentemente tiene la habilidad de modular las propiedades inmunomoduladoras de EcN in vitro e in vivo. Lo cual es similar al comportamiento de HO-1, modulando el perfil de IL-10 e IL-12p70. Además, el efecto de EcN y ChuS no es solamente local, si no también sistémico, porque fue posible detectar diferencias en bazo, hígado, MLN y sangre.
Characterization of neutrophils subpopulation produced in response to Streptococcus pneumoniae infection in a murine model
(2025) Silva Rodríguez, Pedro Hugo; Barrera Rojas, Nelson Patricio; Bueno Ramírez, Susan; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
Streptococcus pneumoniae es una bacteria Gram-positivo y la principal causa de neumonía bacteriana en todo el mundo, afectando principalmente a infantes y personas de edad avanzada. El ciclo infeccioso de esta bacteria comienza con la colonización del tracto respiratorio superior, seguida por la infección del tracto respiratorio inferior. Allí, la bacteria entra en contacto con células epiteliales e inmunes, lo que desencadena la respuesta inmune y el proceso inflamatorio en los pulmones. Los neutrófilos son células inmunes granulocíticas de vida corta y forman parte de la primera línea de defensa del organismo. En la respuesta inmune generada en los pulmones, los neutrófilos desempeñan un papel crucial en la eliminación del patógeno a través de fagocitosis, degranulación y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs). Sin embargo, estudios recientes han demostrado que los neutrófilos también son capaces de controlar la inflamación excesiva en infecciones respiratorias mediante la liberación de citoquinas antiinflamatorias, como IL10. Además, cada vez hay más evidencia de que los neutrófilos son altamente heterogéneos, lo que podría tener consecuencias desconocidas en la progresión de la enfermedad. En este contexto, se han identificado subpoblaciones de neutrófilos en pulmones de ratones sanos e infectados con Streptococcus pneumoniae denominadas FSChigh y FSClow. Sin embargo, aún no está claro si estas subpoblaciones tienen roles específicos durante la infección o funciones de la respuesta inmune. Basado en esto, la hipótesis de esta tesis es que, los neutrófilos de médula ósea de ratón son intrinsecamente heterogéneos y que durante la etapa temprana de la infección por Streptococcus pneumoniae existen dos subpoblaciones de neutrófilos con funciones distintas, donde la proporción de estas subpoblaciones cambia en el tiempo. Para evaluar la hipótesis, primero determinamos la cinética de reclutamiento de las subpoblaciones de neutrófilos en los tiempos iniciales, concluyendo que a las 12 hpi hay un aumento significativo de las subpoblaciones de neutrófilos en los pulmones. Además, evaluamos el patrón de marcadores de membrana en neutrófilos purificados de la médula ósea y observamos que, incluso después de la aislamiento y sin tratamiento, los neutrófilos son altamente heterogéneos y pueden agruparse según sus patrones de marcadores de membrana. Posteriormente, para determinar si ambas subpoblaciones de neutrófilos tienen funciones específicas, aislamos ambas subpoblaciones a las 12 y 24 hpi desde los pulmones y realizamos un análisis de RNA-seq. Los resultados indican que los neutrófilos FSChigh aumentan vías celulares asociadas a la degranulación y la formación de NETs; sin embargo, no fue posible analizar el RNA de los neutrófilos FSClow. Un RNA-seq realizado en neutrófilos totales purificados de pulmón mostró que el perfil transcriptómico es diferente a lo observado en los neutrófilos FSChigh por sí solos, donde funciones como la degranulación están disminuidas. Sin embargo, debido a que se utilizaron distintas metodologías para aislar los neutrófilos, no es posible atribuir estas diferencias solo a la presencia/ausencia de los neutrófilos FSClow. En conjunto, estos resultados concuerdan con las hipótesis propuesta y muestran la plasticidad de los neutrófilos durante las infecciones bacterianas.
Characterization of OPA1 disease-related mutations and their effect on mitochondrial fusion dynamics, cristae organization and calcium homeostasis
(2020) Cartes Saavedra, Benjamín Tomás; Eisner Sagüés, Verónica Raquel; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La fusión de la membrana interna mitocondrial y la forma de las crestas mitocondriales son dependientes de la proteína OPA1. Mutaciones en el gen de OPA1 provocan una enfermedad llamada Atrofia Óptica Autosómica Dominante (ADOA), la cual es una de las principales causas de ceguera hereditaria. Los dominios GTPasa y el dominio effector de la actividad GTPasa (GED) son esenciales para el papel de OPA1 en su actidiad de fusión, sin embargo, el papel específico que cumple cada dominio en las funciones de OPA1 aun son aún desconocidos. Interesantemente, pacientes con mutaciones en el domino GTPasa tienen un mayor riesgo de desarrollar síntomas multisistémicos. En este estudio, se analizaron mutaciones de OPA1 en los dominios GTPasa y GED para entender la contribución de cada dominio a la función de la proteína, mediante experimentos con células de pacientes con ADOA or experimentos de ganancia de función en líneas celulares. Las mutantes de OPA1 en el dominio GTPasa y GED mostraron alteraciones diferenciales en la ultraestrcutrua mitocondrial. Además, la presencia de todas las mutantes inhibieron la actividad de fusión de las mitocondrias, sin embargo, algunas mutantes del dominio GTPasa presentaron una red mitocondrial hiperelongada. En este trabajo encontramos que el dominio GED es crucial para una actividad GTPasa adecuada. Sin embargo, el dominio GED, a diferencia del dominio GTPasa, no es requerido para mediar la fusión de las mitocondrias. Además, pesar de que el GED es un dominio de interacción con proteínas, este no sería necesario para formar oligomeros de OPA1. Finalmente, estudiamos el papel de OPA1 y sus dominios en la homeostasis del calcio intracelular, encontrando que la proteína, a través de su dominio GED, cumple un papel importante en la transferencia del calcio desde el Retículo Endoplásmico hacia la mitocondria. En resumen, las mutantes dominio-específicas de OPA1 muestran caracteríticas y funciones diferentes en la ultraestrcutura mitocondrial, acitidad de fusión de las mitocondrias y homeostasis del calcio intracelular, pudiendo ser éstas funciones clave en la severidad y progresión de la enfermedad de ADOA.
“Characterization of the effects induced by ADAR1 over long non-coding RNAs A-to-I editing and expression levels in breast cancer”
(2020) Rojas de Santiago, Pamela Roxana; Armisén Yáñez, Ricardo; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
La enzima Adenosina desaminasa que actúa sobre ARNs 1 (ADAR1, del inglés Adenosine deaminase acting on RNAs 1) ha sido ampliamente descrita como un factor modulador de la edición, niveles de expresión y función de sus ARNs blancos, pudiendo ser estos codificantes y no-codificantes. Entre los últimos, los ARNs largos no-codificantes (lncRNAs, del inglés long non-coding RNAs) (> 200 nt de largo) se han destacado por ser componentes centrales en procesos celulares tanto fisiológicos como patológicos. En cáncer de mama, ambos ADAR1 y lncRNAs, han sido caracterizados como elementos clave en vías de señalización oncogénicas y supresoras de tumores. Sin embargo, sólo unos pocos reportes en la literatura abordan la relación ADAR1-lncRNAs, quedando mucho por entender a escala transcriptómica. Por este motivo, esta tesis está enfocada principalmente en abordar los efectos inducidos por ADAR1 tanto en los niveles de expresión como en la edición de lncRNAs y cómo esto podría estar relacionado a la progresión del cáncer. Mediante el uso de datos de secuenciación de ARN (RNA-seq), detectamos que ADAR1 puede modular la expresión de varios lncRNAs, encontrando que el RNA 944 intergénico largo no codificante (LINC00944) respondía de forma consistente a la ganancia y pérdida de función de ADAR1. Al analizar los datos de pacientes de la cohorte de cáncer de mama de The Cancer Genome Atlas (TCGA-BRCA), encontramos que bajos niveles de LINC00944 se correlacionan con fenotipos malignos, como una fracción menor de infiltración linfocitaria en el microambiente tumoral (TILs, del inglés tumor-infiltrating lymphocytes) y con una disminución en la expresión de marcadores pro-apoptóticos. En la misma línea, encontramos que una baja expresión de LINC00944 se correlaciona con un mal pronóstico en pacientes, ya que la disminución en su expresión se correlacionó con una reducción en la supervivencia general y supervivencia libre de recaídas. La sobreexpresión de ADAR1 se ha asociado a un mal pronóstico en pacientes con cáncer de mama triple-negativo (TNBC, del inglés triple-negative breast cancer). Al analizar la cohorte de TCGA-BRCA, demostramos que ADAR1 induce la edición A-por-I en aproximadamente el 10% de los lncRNA expresados en tumores TNBC. Asimismo, encontramos que éstos transcritos fueron editados en una alta proporción. En la presente tesis, nosotros ilustramos dos ejemplos de cómo la edición A-por-I podría estar alterando la función de lncRNAs: ya que PVT1 presentó el mayor número de posiciones editadas, hipotetizamos que su función de lncRNA esponja está siendo diversificada por la edición A-por-I y de esta forma permitiendo la progresión del cáncer. Por otro lado, planteamos la hipótesis de que la capacidad de PINK1-AS1 para estabilizar su ARNm sentido PINK1, puede verse alterada mediante la edición del lncRNA en tumores TNBC y que, en este contexto, podría ser maligna.
Contribution of Fc gamma receptors to the pathology induced by human metapneumovirus in a murine model
(2020) Acevedo Acevedo, Orlando Andrés; Kalergis Parra, Alexis Mikes; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El Metapneumovirus humano (MPVh) es una de las principales causas de infecciones graves de las vías respiratorias inferiores y de hospitalización en niños menores de cinco años. La evidencia clínica indica que estos casos graves de infección por MPVh se acompañan de una infiltración masiva de neutrófilos orquestada por la acción coordinada de macrófagos y células dendríticas (CDs). Sin embargo, los mecanismos que regulan esta respuesta inflamatoria siguen siendo poco conocidos. Las evidencias de otros estudios destacan el papel de los receptores de la porción Fc de la inmunoglobulina G (FcγRs) en la modulación de la función y el reclutamiento de las CDs, así como de los macrófagos y neutrófilos durante la inflamación. Como parte de la tesis doctoral, investigamos el papel del receptor de IgG murino canónicamente inhibidor FcγRIIb y canónicamente activador FcγRIII en la respuesta de neutrófilos desencadenada por la infección por MPVh. Además, también determinamos si la falta de tales receptores regula la infiltración de macrófagos y CDs que, además de los neutrófilos, orquestan la respuesta innata frente al MPVh. Utilizando neutrófilos purificados, también examinamos el papel putativo del MPVh y del MPVh opsonizado con IgG en la forma de inmuno-complejos de MPVh (MPVh-ICs) en la regulación de la expresión de ambos receptores, que a su vez pueden modular la función de los neutrófilos en un contexto in vivo. Con una estrategia similar, también determinamos si estos estímulos regulan la apoptosis de los neutrófilos, la producción de especies reactivas de oxígeno (EROS), así como la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (TENs), que en conjunto pueden contribuir a una mayor inflamación de las vías respiratorias después de la infección por MPVh. Los resultados de este estudio indican que la infección por MPVh produce daño pulmonar, evidenciado como un aumento de la puntuación de histopatología pulmonar en ratones WT en comparación con controles no infectados, que no se observó en ratones FcγRIIb- /- y ratones FcγRIII - /- , lo que sugiere que ambos receptores contribuyen a la inflamación desencadenada por MPVh en los pulmones. Además, la infección por MPVh aumenta el número medio de neutrófilos viables en las vías respiratorias y pulmones de ratones WT, pero no en ratones FcγRIIb -/- y FcγRIII-/- , lo que sugiere que ambos receptores contribuyen al reclutamiento de neutrófilos y después de la infección por MPVh. Además, una deficiencia de ya sea FcγRIIb o FcγRIII atenúa el incremento de Macrófagos intersticiales (MIs) en el pulmón y lavado broncoalveolar de ratones WT luego de la infección con MPVh los cuales en conjunto con los neutrófilos podría contribuir a la obstrucción de las vías respiratorias durante la infección. En contraste, una deficiencia de ya sea FcγRIIb o FcγRIII evita la reducción en los niveles de Macrófagos Alveolares (MAs) viables que se observa después de la infección de ratones WT y que de acuerdo con estudios previos podrían contribuir al reclutamiento de neutrófilos en las vías aéreas y el tejido pulmonar. Por otro lado, también demostramos que el MPVh opsonizado con IgG y el MPVh por si solo previenen la apoptosis constitutiva de neutrófilos purificados los que a su vez desencadenan la producción de EROS y TENs que en conjunto pueden contribuir al daño pulmonar producida por la infección de MPVh. En conclusión, nuestros resultados sugieren que el bloqueo de la interacción entre FcγRs específicos y MPVh opsonizado con IgG podría usarse como una nueva estrategia terapéutica para prevenir la respuesta inflamatoria pulmonar contra este virus. En este contexto, el uso de anticuerpos monoclonales con porciones Fc modificadas y que reconozcan proteínas de superficie de MPVh, que pueden activar FcγRs distintos de FcγRIIb y FcγRIII, podría usarse como tratamientos profilácticos o terapéuticos novedosos para disminuir la inflamación pulmonar causada por la infección con MPVh.
Contribution of the human respiratory syncytial virus to the susceptibility to infection by mycobacteria in a murine model.
(2019) Canedo Marroquín, Gisela Eliana; Kalergis Parra, Alexis Mikes; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
El Virus Respiratorio Sincicial humano (VRSh) pertenece a la familia Pneumoviridae y es considerado el principal virus respiratorio causante de las infecciones agudas del tracto respiratorio bajo en niños inmunocomprometidos, prematuros, infantes y ancianos. Los mayores niveles de infección asociados a VRSh son asociados a los meses de otoño e invierno. Alproducir patologías agudas asociadas al tracto respiratorio bajo como la bronquiolitis y la pneumonía, el paciente debe permanecer con oxígeno suplementario, así como también puede requerir ventilación mecánica, siendo los días hospitalizados por VRSh de alto costo en el sistema de salud pública. Debido a que no existe una vacuna comercial que prevenga la infección por este virus respiratorio, se registra anualmente un colapso en los hospitales a nivel mundial. Además, se ha podido relacionar la infección causada por este virus, es capaz de promover consecuencias como susceptibilidad a alergia, desarrollo el asma e incluso patologías crónicas como la enfermedad pulmonar crónica obstructiva. Más aún, se ha asociado la posibilidad de superinfecciones en las cuales otro agente patógeno puede infectar el epitelio pulmonar, días después de la infección de VRSh y generar una patología mayor en el hospedero. Por otra parte, se sabe que hRSV puede establecer coinfecciones con otros microorganismos ya sea bacteriano o viral. En estudios de cohortes de pacientes, se ha determinado que pacientes que presentan un mayor número de días de hospitalización, así como también administración de oxígeno o ventilación mecánica, se debe a pacientes con infección de VRSh y otro microorganismo. Otro agente respiratorio importante es Mycobacterium tuberculosis, el cual es ampliamente estudiado dado que, a pesar de que tiene una vacuna para prevenirlo, continua con portadores en el mundo. En Chile se reportan nuevos casos de tuberculosis cada año, por lo que sigue siendo un problema de salud pública para nuestro país. Una forma segura de estudiar esta micobacteria es usando la cepa atenuada de Mycobacterium bovis, el Bacillus Calmette Guérin. En esta tesis doctoral se demostró que la infección del epitelio pulmonar con VRSh permite que una infección secundaria con micobacteria que puede colonizar y adoptar un fenotipo dormante, ya que permanece en el hospedero cubierta por gotas de lípidos, esto se produce por apropiación del metabolismo lipídico de la célula del hospedero. Este fenómeno ocurre específicamente cuando la infección por VRSh sucede diez días previos a la de micobacteria. En el caso de alcanzar más de veinte días después de la infección con VRSh, el fenómeno no se observa. Finalmente, también se estudió la coinfección de VRSh y micobacteria, se pudo establecer que la infección primaria con VRSh no se ve afectada en el hospedero incluso con la inoculación de la micobacteria, sin embargo, en el caso inverso la micobacteria no permite la infección de VRSh en las células.

Browse

Browsing Facultad de Ciencias Biológicas by Subject "03 Salud y bienestar"

Results Per Page

Sort Options