Browsing by Author "Retamal Farfán, Ignacio Andrés"

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    Alteración del período circadiano del reloj proteico KaiABC mediante diseño racional del estado de transición de replegamiento de la proteína metamórfica KaiB
    (2023) Retamal Farfán, Ignacio Andrés; Ramírez Sarmiento, César Antonio; Rivera Valdés, Maira; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
    La proteína metamórfica KaiB regula el reloj biológico de cianobacterias KaiABC mediante la interconversión de su estructura. Este tipo de proteínas pueden adoptar más de un estado termodinámicamente estable y responsable de su función biológica, lo que desafía a la clásica noción de “una secuencia - una estructura - una función”. Durante el día, KaiB forma un homotetrámero (gsKaiB), mientras que por la noche se transforma a un monómero (fsKaiB). Este cambio en el estado oligomérico va acompañado con cambios en su estructura secundaria y terciaria en su mitad C-terminal. Previo a este trabajo, el mecanismo de metamorfosis y los residuos relevantes para la formación de la transición metamórfica eran desconocidos. En la presente tesis, mediante simulaciones de dinámica molecular con modelos basados en estructura (SBMs) de doble cuenca, se dilucidan los estados de transición y el mecanismo de metamorfosis de KaiB, el cual sigue como ruta gs2⇄2gs⇄2fs, con la disociación del dímero de gs como el paso limitante del proceso. Utilizando criterios de probabilidad de formación de contactos nativos y cambios en frustración energética local, se identificaron 5 residuos relevantes para la formación del estado de transición de la interconversión monomérica gs⇄fs (R5, T18, R23, K37 y K58). A partir de los análisis de frustración energética, se propusieron mutantes que estabilizaran a estos residuos en el estado de transición, las que se evaluaron en fsKaiB, gsKaiB y el complejo fsKaiB-KaiC. Apuntando al objetivo de alterar el período del reloj mediante la modulación cinética de la transformación de KaiB, se consideraron aquellas mutantes que minimizaran la frustración energética en las estructuras del estado de transición y estados finales, las cuales fueron T18C, K37I y K37V. Adicionalmente, se ha reportado que al mutar el residuo arginina 23 por cisteína (R23C) cambia el periodo del reloj a 26 h, lo que probablemente se deba a su interacción con KaiC. Esta observación se condice con nuestros análisis de frustración, en donde se observa que la mutante R23C disminuye la frustración local del residuo en su estado fsKaiB-KaiC. Es por esto que se realizaron experimentos preliminares reconstituyendo el reloj KaiABC silvestre in vitro, que se complementaron con el diseño de un sistema de tomas de muestra automatizado, logrando observar la oscilación del estado de fosforilación de KaiC con un período de 24 h. En base a los resultados obtenidos se proyecta que el uso de herramientas bioinformáticas, como SBMs duales y análisis de frustración energética, son relevantes para comprender el mecanismo de transformación de proteínas metamórficas oligoméricas e incluso podrían ser usadas en el diseño de relojes biológicos sintéticos.