Browsing by Author "Molina Ramírez, José Alejandro"

Now showing 1 - 2 of 2
  • Thumbnail Image
    Item
    Differential Local Stability Governs the Metamorphic Fold Switch of Bacterial Virulence Factor RfaH
    (2020) Galaz Davison, Pablo; Molina Ramírez, José Alejandro; Silletti, S; Komives, EA; Knauer, SH; Artsimovitch, I; Ramirez-Sarmiento, Cesar A.
  • Thumbnail Image
    Item
    Diseño de un switch molecular inducido por ligandos en la proteína metamórfica RfaH para el control de la expresión génica en Escherichia coli
    (2024) Molina Ramírez, José Alejandro; Ramírez Sarmiento, César Antonio; Pontificia Universidad Católica de Chile. Escuela de Ingeniería
    El plegamiento es un proceso específico por el cual un polímero de aminoácidos alcanza una estructura tridimensional única y compatible con su función, o estado nativo. Sin embargo, las proteínas metamórficas desafían este paradigma, ya que una misma secuencia de aminoácidos se pliega en diferentes estados nativos. Además, la transformación estructural reversible entre estados controla su actividad. El factor de transcripción RfaH es uno de los ejemplos más notorios de una proteína metamórfica. RfaH es un parálogo especializado de la familia de factores universales NusG, asociado con patogenicidad bacteriana. Su especialización está dada por el reconocimiento de secuencias específicas de ADN y por plegarse en dos estados nativos: su dominio carboxilo terminal (CTD) puede estar en un estado autoinhibido de horquilla α-helicoidal unido al dominio amino terminal (NTD) o en un estado activo como un barril β libre. Dado este cambio estructural y los elementos que lo controlan, RfaH constituye un switch molecular. Este tipo de proteínas experimentan cambios conformacionales en respuesta a un estímulo. En este sentido, una estrategia versátil para diseñar nuevos switches ha sido la inserción de dominios, en donde un dominio de unión, encargado de reconocer una señal, es fusionado a un dominio funcional, asociado con la función de interés. En este proyecto, RfaH fue utilizada para diseñar un switch molecular con respuesta a nuevas señales mediante ingeniería de proteínas. Primero, se determinó el mecanismo de plegamiento de RfaH y diferencias en estabilidad de sus estados nativos mediante ensayos de desplegamiento. RfaH mostró un desplegamiento cooperativo y sin intermediarios en el estado autoinhibido. Luego, mediante estudios de dinámica estructural, se determinaron regiones apropiadas en RfaH para la inserción de dominios de unión a ligandos. Se observaron diferencias de estabilidad y flexibilidad entre los estados α y β que no solo explican la especialización de RfaH en comparación a sus homólogos no metamórficos, sino que funcionalmente ejercen un control alostérico sobre la maquinaria transcripcional. Finalmente, se insertaron en RfaH dominios que muestran un notorio cambio conformacional en respuesta a la unión de ligandos, para controlar su conversión α→β y provocar su concomitante activación. El cambio estructural de RfaH en respuesta al ligando fue analizado con ensayos de desplegamiento y cambios en dinámica estructural local por anisotropía de fluorescencia. Se observó que la estructura de RfaH solo se ve modificada en presencia del ligando. Los resultados de este proyecto apoyan el uso de proteínas metamórficas para diseñar nuevos switches. La ingeniería de proteínas con RfaH podrá ser aplicada al control de la expresión génica o el desarrollo de biosensores.