Browsing by Author "Carvajal Díaz, Felipe Alonso"

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    Effect of recombinant protein production and release on microalgal fitness and the impact of environmental conditions for localized therapeutic delivery
    (Springer Nature, 2025) Carvajal Díaz, Felipe Alonso; Vargas Torres, Valentina Isabel; Becerra, Daniela; González Quezada, Nicolás Marcelo Orlando; Egaña, José T.
    Backgroud Genetically engineered photosynthetic microorganisms have been proposed as a therapeutic approach for the localized delivery of oxygen and recombinant proteins to tissues in various pathological conditions. However, the effect of recombinant protein production and secretion on microalgal fitness, as well as the impact of key environmental conditions on their potential therapeutic performance, has not yet been described. Therefore, in this study, the microalga Chlamydomonas reinhardtii was genetically engineered to produce and release the reporter protein mVenus and was then challenged by exposure to different media, temperatures, and substrates. Results The genetically modified microalgae were able to produce and release the mVenus protein under standard culture conditions without affecting overall fitness, including cell size and shape, growth potential, and oxygen metabolism, compared to the wild-type strain. Under mammalian cell culture conditions, the strains continued to produce and secrete mVenus protein for up to four days at 22 °C, 30 °C, and 37 °C. Additionally, photosynthetic biomaterials containing the engineered microalgae showed continuous recombinant protein release at 30 °C and 37 °C for up to four days. Conclusion The microalga Chlamydomonas reinhardtii can be genetically engineered to produce and release recombinant proteins without detrimental effects on its fitness, showing therapeutic potential under mammalian culture conditions and within biomaterials designed to promote tissue regeneration. Overall, these findings support the use of genetically engineered photosynthetic microalgae for the localized and controlled release of oxygen and recombinant proteins for several therapeutic applications.
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    Estructuras de RNA y su impacto sobre el inicio de la traducción del mRNA genómico de HIV-1 y del SmRNA de ANDV
    (2019) Carvajal Díaz, Felipe Alonso; López Lastra, Marcelo Andrés; Pontificia Universidad Católica de Chile. Facultad de Ciencias Biológicas
    La síntesis de proteínas es el proceso por el cual la información contenida en un RNA mensajero (mRNA) es decodificada para sintetizar la correspondiente cadena polipeptídica. El proceso de síntesis de proteínas se divide en 4 etapas principales: iniciación, elongación, terminación y reciclaje de ribosomas. El inicio de la síntesis de proteínas, la cual es la etapa más regulada de la traducción, comprende el reclutamiento de los factores de inicio de la traducción y de la subunidad 40S ribosomal sobre el mRNA a ser traducido, el proceso de búsqueda del codón de inicio o scanning, y el ensamblaje y posicionamiento del ribosoma 80S sobre el codón de inicio. En el mRNA existen estructuras canónicas necesarias para un proceso eficiente de inicio de la traducción, tales como la estructura cap en el extremo 5’, y la cola poliadenilada (poly(A)) en el extremo 3’ de éste. Dichas estructuras permiten el reclutamiento de los factores de inicio, así como la circularización no covalente del mRNA. A su vez, las regiones 5’ y 3’ no traducidas (UTRs) del mRNA contribuyen en la regulación del proceso de inicio, modulando la eficiencia del reclutamiento de la maquinaria traduccional. En este respecto, las estructuras de RNA presentes en las regiones UTR son moduladores importantes del proceso de inicio de la síntesis de proteínas. Algunos mRNAs de origen viral utilizan mecanismos alternativos para reclutar los complejos de inicio de la traducción, otorgándoles una ventaja por sobre los demás mRNAs dentro de la célula. Parte de estos mecanismos no canónico se basan en la presencia de estructuras de RNA en las regiones UTR del mRNA, las cuales pueden mediar la síntesis de proteínas de forma independiente de la estructura cap o de la cola poly(A). Para ahondar en el conocimiento de los mecanismos de regulación del inicio de la traducción no canónico, en este trabajo de tesis, se eligieron dos modelos de mRNAs virales, los cuales permiten caracterizar por un lado el inicio de la síntesis de proteínas cap-independiente, y por otro, el inicio de la traducción poly(A) independiente. El primer modelo utilizado fue el mRNA completo del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (HIV-1). Este mRNA viral posee en su región 5’UTR un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Para este modelo, se determinó el funcionamiento del elemento HIV-1 IRES en diferentes tipos celulares. Se estableció que este IRES es de naturaleza modular, diferenciándose así de los IRES de origen viral. Se determinó además que el elemento HIV-1 IRES no requiere del proceso de scanning para iniciar la síntesis de proteínas, reclutando los complejos de inicio directamente sobre el codón de inicio. El segundo modelo estudiado correspondió al mRNA del segmento S (SmRNA) del Orthohantavirus Andes (ANDV). Este mRNA viral posee una estructura 5’-cap, pero carece de cola poly(A). A pesar de esto, el SmRNA es traducido, dando origen a las proteínas virales N y NSs. En este trabajo se caracterizaron las estructuras secundarias de RNA presentes en la región 5’ y 3’ UTR del SmRNA de ANDV mediante la estrategia de SHAPE. Se determinó la estructura de la región 5’UTR y se estableció que las estructuras de RNA presentes en ella regulan el inicio de la traducción del SmRNA. Para la región 3’UTR del SmRNA, se caracterizó las estructuras de RNA existentes, sin embargo, no fue posible asignan una estructura única a esta región puesto que los resultados sugieren que más bien se comportaría como un elemento dinámico. En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis permiten ahondar en el entendimiento de la regulación del proceso de inicio de la síntesis de proteínas no canónico en modelos de mRNAs virales.La síntesis de proteínas es el proceso por el cual la información contenida en un RNA mensajero (mRNA) es decodificada para sintetizar la correspondiente cadena polipeptídica. El proceso de síntesis de proteínas se divide en 4 etapas principales: iniciación, elongación, terminación y reciclaje de ribosomas. El inicio de la síntesis de proteínas, la cual es la etapa más regulada de la traducción, comprende el reclutamiento de los factores de inicio de la traducción y de la subunidad 40S ribosomal sobre el mRNA a ser traducido, el proceso de búsqueda del codón de inicio o scanning, y el ensamblaje y posicionamiento del ribosoma 80S sobre el codón de inicio. En el mRNA existen estructuras canónicas necesarias para un proceso eficiente de inicio de la traducción, tales como la estructura cap en el extremo 5’, y la cola poliadenilada (poly(A)) en el extremo 3’ de éste. Dichas estructuras permiten el reclutamiento de los factores de inicio, así como la circularización no covalente del mRNA. A su vez, las regiones 5’ y 3’ no traducidas (UTRs) del mRNA contribuyen en la regulación del proceso de inicio, modulando la eficiencia del reclutamiento de la maquinaria traduccional. En este respecto, las estructuras de RNA presentes en las regiones UTR son moduladores importantes del proceso de inicio de la síntesis de proteínas. Algunos mRNAs de origen viral utilizan mecanismos alternativos para reclutar los complejos de inicio de la traducción, otorgándoles una ventaja por sobre los demás mRNAs dentro de la célula. Parte de estos mecanismos no canónico se basan en la presencia de estructuras de RNA en las regiones UTR del mRNA, las cuales pueden mediar la síntesis de proteínas de forma independiente de la estructura cap o de la cola poly(A). Para ahondar en el conocimiento de los mecanismos de regulación del inicio de la traducción no canónico, en este trabajo de tesis, se eligieron dos modelos de mRNAs virales, los cuales permiten caracterizar por un lado el inicio de la síntesis de proteínas cap-independiente, y por otro, el inicio de la traducción poly(A) independiente. El primer modelo utilizado fue el mRNA completo del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (HIV-1). Este mRNA viral posee en su región 5’UTR un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Para este modelo, se determinó el funcionamiento del elemento HIV-1 IRES en diferentes tipos celulares. Se estableció que este IRES es de naturaleza modular, diferenciándose así de los IRES de origen viral. Se determinó además que el elemento HIV-1 IRES no requiere del proceso de scanning para iniciar la síntesis de proteínas, reclutando los complejos de inicio directamente sobre el codón de inicio. El segundo modelo estudiado correspondió al mRNA del segmento S (SmRNA) del Orthohantavirus Andes (ANDV). Este mRNA viral posee una estructura 5’-cap, pero carece de cola poly(A). A pesar de esto, el SmRNA es traducido, dando origen a las proteínas virales N y NSs. En este trabajo se caracterizaron las estructuras secundarias de RNA presentes en la región 5’ y 3’ UTR del SmRNA de ANDV mediante la estrategia de SHAPE. Se determinó la estructura de la región 5’UTR y se estableció que las estructuras de RNA presentes en ella regulan el inicio de la traducción del SmRNA. Para la región 3’UTR del SmRNA, se caracterizó las estructuras de RNA existentes, sin embargo, no fue posible asignan una estructura única a esta región puesto que los resultados sugieren que más bien se comportaría como un elemento dinámico. En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis permiten ahondar en el entendimiento de la regulación del proceso de inicio de la síntesis de proteínas no canónico en modelos de mRNAs virales.